• ASO PCR
• biopsie liquide
• cell-free DNA (cfDNA)
• DNA libero circolante
• KRAS
• liquid biopsies
• MGUS
• mieloma multiplo
• multiple myeloma
• NRAS

Il mieloma multiplo (MM, multiple myeloma) è una neoplasia maligna dei linfociti B terminalmente differenziati e si configura come una malattia progressiva il cui sviluppo è consistentemente preceduto da un disturbo clonale premaligno chiamato gammopatia monoclonale di significato indeterminato (MGUS, monoclonal gammopathy of undetermined significance), la cui evoluzione in MM può passare attraverso uno stadio intermedio ancora premaligno denominato mieloma multiplo smoldering (SMM, smoldering multiple myeloma).
Nella pratica clinica, il profilo genetico dei pazienti viene determinato utilizzando biopsie di tessuto tumorale (midollo osseo), che, però, non sono del tutto adatte per il rilevamento della eterogeneità genetica tipica del MM e, inoltre, hanno una natura invasiva. Una metodica alternativa per la caratterizzazione genetica della malattia può essere rappresentata dalle biopsie liquide (LB, liquid biopsies), che consistono nel campionamento e nell'analisi di fluidi biologici (più comunemente sangue) per la ricerca di componenti tumorali circolanti, che possono essere utilizzate come surrogati del tessuto neoplastico in quanto fonte di utili biomarcatori.
Questo lavoro di tesi fa parte di un progetto più ampio rappresentato dalla costruzione di una biobanca di campioni di sangue periferico e midollare di pazienti affetti da MGUS, SMM e MM, e ha come obiettivo principale lo sviluppo di un metodo rapido ed economico, quale quello di allele-specific oligonucleotide PCR (ASO PCR), per analizzare le LB di pazienti con MGUS, e in particolare il DNA libero circolante (cfDNA, circulating cell-free DNA) purificato da campioni di plasma, al fine di valutare la prevalenza di eventi genetici potenzialmente implicati nella progressione della malattia. L'attenzione è stata rivolta in particolare a mutazioni puntiformi che colpiscono i codoni 12, 13 e 61 dei geni NRAS e KRAS, che sono riportati come i geni più frequentemente mutati nel MM.
Da campioni di plasma è stato estratto il cfDNA, poi sottoposto a quantificazione e a un’analisi qualitativa. Successivamente sono stati progettati primer ASO per le mutazioni osservate nel MM nei codoni 12, 13 e 61 dei geni NRAS e KRAS, con lo scopo di utilizzarli per l'analisi del cfDNA dei pazienti in condizioni di real time PCR (RT PCR). La specificità e sensibilità dei primer sono state testate su DNA genomici di linee cellulari tumorali commerciali aventi le specifiche mutazioni per le quali i primer sono stati progettati, dopodiché la metodica è stata applicata a campioni di cfDNA.
I risultati ottenuti da questo lavoro sono preliminari e non hanno permesso di stabilire se il sistema sviluppato possa essere valido per condurre un'analisi mutazionale sufficientemente sensibile su LB di pazienti con MGUS. Sarà necessario, in futuro, analizzare un numero maggiore di campioni e consolidare i risultati attraverso l'applicazione di una tecnica più sensibile, ma allo stesso tempo più costosa e complessa, quale la digital droplet PCR (ddPCR).
L'obiettivo a lungo termine è capire se sia possibile rilevare potenziali marcatori genetici di progressione già nello stadio premaligno utilizzando semplici prelievi di sangue periferico analizzati con comuni tecniche di PCR, con lo scopo di fornire alla pratica clinica una metodica minimamente invasiva e facilmente accessibile per identificare precocemente i pazienti a rischio di evoluzione e avviarli a trattamenti mirati prima della comparsa dei segni e dei sintomi della malattia.

Multiple myeloma (MM), a malignant neoplasm of terminally differentiated B lymphocytes, is a progressive disease whose development is consistently preceded by a premalignant clonal disorder called monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS), whose evolution towards MM can go through a still premalignant intermediate stage called smoldering multiple myeloma (SMM).
In clinical practice, the genetic profile of patients is determined using biopsies of tumour tissue (bone marrow), which, however, are not entirely suitable for the detection of the genetic heterogeneity typical of MM and, moreover, have an invasive nature. An alternative method for the genetic characterization of the disease can be represented by liquid biopsies (LB), which consist in the sampling and analysis of biological fluids (most commonly blood) for the search of circulating tumour components, which can be used as surrogates for neoplastic tissue as a source of useful biomarkers.
This thesis work is part of a larger project represented by the construction of a biobank of peripheral blood and bone marrow samples from patients affected by MGUS, SMM and MM. Its main aim is the development of a rapid and economic method, such as that of allele-specific oligonucleotide PCR (ASO PCR), to analyse the LBs of patients with MGUS, and in particular the circulating cell-free DNA (cfDNA) purified from plasma samples, in order to evaluate the prevalence of genetic events potentially implicated in disease progression. Attention has been paid particularly to point mutations affecting codons 12, 13 and 61 of the NRAS and KRAS genes, which are reported as the most frequently mutated genes in MM.
The cfDNA was extracted from plasma samples, and then subjected to quantification and a qualitative analysis. Subsequently, ASO primers were designed for the mutations observed in MM in codons 12, 13 and 61 of the NRAS and KRAS genes, with the aim of using them for the analysis of patients' cfDNA under real time PCR (RT PCR) conditions. The specificity and sensitivity of the primers were tested on genomic DNAs of commercial tumour cell lines having the specific mutations for which the primers were designed, then the method was applied to cfDNA samples.
The results obtained from this work are preliminary and did not allow to establish whether the developed system could be valid for conducting a sufficiently sensitive mutational analysis on LBs of patients with MGUS. It will be necessary, in the future, to analyse a greater number of samples and consolidate the results through the application of a more sensitive technique, but at the same time more expensive and complex, such as digital droplet PCR (ddPCR).
The long-term goal is to understand whether it is possible to detect potential genetic markers of progression already in the premalignant stage using simple peripheral blood samples analysed with common PCR techniques, with the aim of providing clinical practice with a minimally invasive and easily accessible method to early identify patients at risk of evolution and start them to targeted treatments before the onset of signs and symptoms of the disease.