• acetilcolinesterasi
• anti-colinesterasi
• Biomonitoraggio
• inibizione

L’impiego dei biomarkers nelle attività di monitoraggio della contaminazione ambientale è, da molto tempo, considerato uno strumento prognostico/diagnostico finalizzato alla rilevazione di effetti precoci ai livelli più bassi dell’organizzazione biologica(molecole, cellule) che potenzialmente possono interessare i livelli superiori (organismi, popolazioni); in questo ambito i markers di tipo biochimico rivestono un ruolo predominante. In questo lavoro di tesi è stata condotta la caratterizzazione biochimica in vitro degli enzimi appartenenti alla famiglia delle colinesterasi nel polichete Diopatra neapolitana. Le colinesterasi (ChE) rappresentano un biomarker di esposizione a contaminanti ad azione neurotossica, quali i composti appartenenti alla classe degli organo-fosforici e carbammati, di largo impiego nelle attività agricole come pesticidi. La tossicità primaria di queste sostanze è dovuta alla capacità di inibire l’attività di alcune forme di ChE, impedendo una corretta trasmissione degli impulsi nelle sinapsi colinergiche delle giunzioni neuromuscolari con conseguenti disordini nel sistema nervoso-motorio. La specie oggetto dello studio è rappresentata da D. neapolitana, polichete tubicolo e fossorio tipico dei fondi molli delle aree estuariali. Dal punto di vista ecologico D. neapolitana rappresenta fonte di nutrimento per pesci e uccelli acquatici, contribuisce alla stabilizzazione del sedimento e favorisce l’insediamento e l’adesione di alcune specie algali; in aggiunta questa specie ha un notevole valore economico in quanto oggetto di raccolta e vendita come esca per la pesca sportiva.
La caratterizzazione è stata condotta indagando l’affinità dell’enzima per diversi substrati (acetil-, butirril-, propionilcolina), i livelli di attività enzimatica in diverse parti del corpo, i principali parametri cinetici (Km e Vmax) e la risposta in vitro a inibitori modello (eserina, iso-OMPA, BW284C51) e alcuni carbammati (Carbofurano, Methomyl, Aldicarb e Carbaryl). Inoltre le attività enzimatiche sono state visualizzate su gel di poliacrilammide attraverso elettroforesi in condizioni native.
I risultati hanno evidenziato che i substrati maggiormente idrolizzati sono acetil- e propionilcolina, soprattutto nella parte posteriore del verme. Una scarsa attività catalitica è stata evidenziata con il substrato butirrilcolina, confermata dall’analisi elettroforetica. I parametri cinetici sono stati confrontati con la poca letteratura disponibile sui policheti, evidenziando alcune differenze. I carbammati selezionati nello studio hanno mostrato una maggiore potenza di inibizione dell’attività colinesterasica condotta con la propionilcolina come substrato. Aldicarb ha evidenziato il maggiore effetto inibitorio delle attività.

The use of biomarkers in environmental pollution monitoring activities is long deemed a diagnostic/prognostic tool aiming to reveal early pollutant effects at the lowest biological organization levels (molecules, cells), which are potentially able to involve higher biological organization levels (organisms, populations). In this field, biochemical markers play a predominant role.
In this thesis, biochemical characterization of enzymes of the cholinesterases family in the polychaete Diopatra neapolitana is carried out. Cholinesterases (ChE) are a biomarker of exposure to neurotoxic pollutants such as organophosphorus and carbamate compounds, broadly applied as pesticides in agriculture. Primary toxicity of these compounds is due to their capability to inhibit the activity of some ChE forms, thus impeding normal signal transmission in neuromuscular cholinergic junctions with consequent neuromuscular disorders.
Diopatra neapolitana is a estuarine soft bottom polychaete tube worm. From the ecological viewpoint, this species represents a feeding source for fish and aquatic birds, it contributes to substrate stabilization, it facilitates the settlement and adhesion of some algal species. Furthermore, this species has a remarkable economic value since it is harvested and sold as fishing bait.
Biochemical characterization was carried out investigating the enzyme affinity for different substrates (acetyl-, propionyl-, butyrylcholine), levels of enzymatic activity in different body parts, main kinetic parameters (Vmax and Km) and in vitro response to model inhibitors (Eserine, BW284C51, iso-OMPA) and some carbamates (Carbofuran, Methomil, Carbaryl, Aldicarb). Moreover, enzymatic activities were visualized on non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.
Results indicated that acetil- and propyonilcholine were the most hydrolyzed substrates, above all in the posterior end of the body. Poor catalytik activity was detected with the butyrylcholine substrate, as confirmed in the electrophoresis analysis. Kinetic parameters were compared with the insufficient literature available on polychaetes, showing some differences. Selected carbamates displayed a more powerful inhibition of cholinesterases activity measured with propionylcholine as a substrate. Aldicarb showed the highest inhibitory effect on enzymatic activities.