• AKR1B10
• anthracycline
• antracicline
• cancer
• cancro
• CBR1
• reductases
• reduttasi
• resistance
• resistenza

Il tumore polmonare non a piccole cellule (Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC) rappresenta la prima causa di morte tumorale associata a malattie polmonari, con un tasso di sopravvivenza successivo alla diagnosi che non supera il 15%. Le cause primariamente associate allo sviluppo di questa neoplasia si ritrovano nel fumo di sigaretta, ma anche un’esposizione a particelle α o sostanze cancerogene quali l’amianto.
Il modello di studio del lavoro di tesi è stato la linea cellulare A549 che consiste in cellule epiteliali basali alveolari ipotriploidi a carattere squamoso. Questa linea è stata sviluppata per la prima volta da D. J. Giard et al. nel 1972 coltivando il tessuto espiantato dal tumore di un uomo caucasico di 58 anni. Dati di letteratura riportano inoltre come questa linea costituisca un buon modello in vitro per lo studio e la ricerca di terapie innovative volte ad un trattamento più efficace del NSCLC, attraverso un’analisi del profilo di espressione proteica, ed in particolare la modulazione dell’overespressione di alcuni enzimi a carattere ossidoreduttasico, quali le aldo-chetoreduttasi (AKRs) e le deidrogenasi a catena corta (SCDHs). È importante considerare i livelli di espressione di queste attività reduttasiche in quanto il trattamento di questo tipo di tumore prevede, fra le varie terapie, l’utilizzo di antracicline come la doxorubicina (DOX) e la daunorubicina (DNB); di fatto, l’efficacia terapeutica di queste molecole potrebbe risultare ridotta a seguito dell’azione detossificante di tali enzimi in grado di convertire, a livello cellulare le antracicline nei rispettivi metaboliti alcolici, ovvero doxorubicinolo (DOXolo) e daunorubicinolo (DNBolo). Dati di letteratura riportano come in particolare i principali enzimi convolti in questo meccanismo siano l’AKR1B10, membro del sottogruppo AKR1 delle AKRs, e la carbonil reduttasi-1 (CBR1) membro della famiglia delle SCDH. Ciò sarebbe confermato da alcuni studi in cui il trattamento sinergico di antracicline ed inibitori selettivi per questi enzimi determini un incremento dell’efficacia dell’azione chemioterapica.
Innanzitutto è stata caratterizzata la presenza di attività reduttasiche NADPH dipendenti negli estratti grezzi cellulari e contemporaneamente l’espressione specifica di entrambi gli enzimi citati mediante Western blotting utilizzando anticorpi specifici anti-CBR1 ed anti-AKR1B10. Parallelamente è stata valutata l’azione citotossica, misurata con il test dell’MTT, di diverse concentrazioni di doxorubicina e daunorubicina al fine di valutare la quantità necessaria ad indurre il 50% di mortalità dopo 48 ore di incubazione. L’azione di inibitori noti per gli enzimi CBR1 ed AKR1B10 è stata quindi valutata sulle proteine isolate, sia con saggi spettrofotometrici che con la messa a punto di un saggio fluorimetrico, che ha permesso l’utilizzo di queste antracicline come substrati.
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Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) is the leading cause of cancer death associated with lung disease, with a post-diagnosis survival rate of no more than 15 percent. The primary causes associated with the development of this neoplasm are found in cigarette smoking, but also an exposure to α particles or carcinogens such as asbestos.
The study model for the thesis work was the A549 cell line, which consists of hypotryploid squamous alveolar basal epithelial cells. This line was first developed by D. J. Giard et al. in 1972 by culturing tissue explanted from the tumor of a 58-year-old Caucasian man. Data from the literature also report that this line is a good in vitro model for the study and research of innovative therapies aimed at more effective treatment of NSCLC, through an analysis of the protein expression profile, and in particular the modulation of the overexpression of oxidoreductases, such as aldo-keto reductases (AKRs) and short-chain dehydrogenases (SCDHs). It is important to consider the expression levels of these reductase activities as the treatment of this type of tumor includes anthracyclines such as doxorubicin (DOX) and daunorubicin (DNB) among other therapies; in fact, the therapeutic efficacy of these molecules could be reduced as a result of the detoxifying action of these enzymes capable of converting, at the cellular level anthracyclines into their respective alcohol metabolites, namely doxorubicinol (DOXol) and daunorubicinol (DNBol). Literature data report how in particular the main enzymes involved in this mechanism are AKR1B10, a member of the AKR1 subgroup of AKRs, and carbonyl reductase-1 (CBR1) a member of the SCDH family. This would be confirmed by some studies in which synergistic treatment of anthracyclines and selective inhibitors for these enzymes results in increased efficacy of chemotherapeutic action.
First, the presence of these NADPH-dependent enzymes was evidenced both by measuring their enzymatic activity and their specific expression by Western blotting using specific anti-CBR1 and anti-AKR1B10 antibodies. The action of known inhibitors for the enzymes CBR1 and AKR1B10 was then evaluated on the isolated proteins, both by spectrophotometric assays and by the development of a fluorometric assay, which allowed the use of doxorubicin and daunorubicin as substrates. Finally, the cytotoxic action of different concentrations of these anthracyclines on the A549 cell line, as measured by the MTT assay, was evaluated in order to assess the amount required to induce 50 percent mortality after 48 hours of incubation.