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Thesis etd-01022021-124223


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
NENCIONI, MARTINA
URN
etd-01022021-124223
Thesis title
Sviluppo di un saggio in vitro basato sulla fluorescenza per la visualizzazione e la quantificazione della NETosi
Department
FARMACIA
Course of study
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Supervisors
relatore Prof.ssa Trincavelli, Maria Letizia
correlatore Dott.ssa Marchetti, Laura
Keywords
  • NETs
  • NETosi
  • neutrophils
  • HL60
  • differentiation
  • CD11b
  • DAPI
  • fluorescence microscopy
  • MPO
  • fluorometric quantification
Graduation session start date
27/01/2021
Availability
Withheld
Release date
27/01/2091
Summary
È noto ormai da anni il ruolo fondamentale che i neutrofili ricoprono all’interno del
sistema immunitario innato e nella difesa contro l’infezione da patogeni. Questo tipo di
leucociti, infatti, ha la capacità di giungere rapidamente nel sito di flogosi, di riconoscere
i microrganismi e di fagocitarli. Studi più recenti, tuttavia, hanno dimostrato che i
neutrofili possono agire anche attraverso un’altra modalità: la netosi. Si tratta di un
processo di morte controllata, che prevede il rilascio nell’ambiente extra-cellulare dei
NETs (Neutrophil Extracellular Traps), una rete di fibre di cromatina decondensata e
associata a diverse componenti proteiche, che hanno lo scopo di intrappolare i
microrganismi, esponendoli ad un’elevata concentrazione di enzimi antimicrobici e
conducendoli a morte. Ancora molto c’è da scoprire riguardo ai meccanismi che ne
regolano lo sviluppo e l’attivazione. Quel che è evidente, però, è che un’eccessiva
attivazione della netosi e una mancata degradazione dei NETs sono spesso causalmente
implicate nello sviluppo di patologie autoimmuni o neurodegenerative, in cui
contribuiscono a un eccessivo stato infiammatorio che ne peggiora il decorso clinico.
L’obiettivo della presente tesi è stato quello di sviluppare un saggio in vitro per la
visualizzazione e quantificazione della netosi. A tal scopo sono state utilizzate cellule
della linea HL60, cellule promielocitiche tumorali precursori dei neutrofili. Le cellule
sono state sottoposte a differenziamento verso il fenotipo dei neutrofili, che è stato
verificato tramite valutazione dell’espressione di una proteina di superficie cellulare, la
CD11b. È stata quindi indotta la netosi sulle cellule differenziate, sperimentando
protocolli diversi anche per favorirne l’adesione su vetrini adatti a misure di microscopia.
Dopodiché sono state eseguite varie analisi morfologiche tramite tecniche di
microscopia a fluorescenza, che ci hanno permesso di concludere quali fossero i
trattamenti utilizzati più efficienti per visualizzare il processo. Una ulteriore conferma dei risultati ottenuti ci è stata data dalla quantificazione fluorimetrica del DNA
extracellulare, che ci ha permesso di correlare l’aumento di fluorescenza sviluppata nei
vari campioni trattati con la formazione di NETs.
I dati ottenuti indicano che abbiamo ottenuto un saggio robusto e quantitativo, che
potrà in futuro essere usato sia per studiare i meccanismi molecolari delle diverse
patologie in cui la netosi è coinvolta, sia per potenzialmente identificare nuovi target
terapeutici.
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