• CD11b
• DAPI
• differentiation
• fluorescence microscopy
• fluorometric quantification
• HL60
• MPO
• NETosi
• NETs
• neutrophils

È noto ormai da anni il ruolo fondamentale che i neutrofili ricoprono all’interno del
sistema immunitario innato e nella difesa contro l’infezione da patogeni. Questo tipo di
leucociti, infatti, ha la capacità di giungere rapidamente nel sito di flogosi, di riconoscere
i microrganismi e di fagocitarli. Studi più recenti, tuttavia, hanno dimostrato che i
neutrofili possono agire anche attraverso un’altra modalità: la netosi. Si tratta di un
processo di morte controllata, che prevede il rilascio nell’ambiente extra-cellulare dei
NETs (Neutrophil Extracellular Traps), una rete di fibre di cromatina decondensata e
associata a diverse componenti proteiche, che hanno lo scopo di intrappolare i
microrganismi, esponendoli ad un’elevata concentrazione di enzimi antimicrobici e
conducendoli a morte. Ancora molto c’è da scoprire riguardo ai meccanismi che ne
regolano lo sviluppo e l’attivazione. Quel che è evidente, però, è che un’eccessiva
attivazione della netosi e una mancata degradazione dei NETs sono spesso causalmente
implicate nello sviluppo di patologie autoimmuni o neurodegenerative, in cui
contribuiscono a un eccessivo stato infiammatorio che ne peggiora il decorso clinico.
L’obiettivo della presente tesi è stato quello di sviluppare un saggio in vitro per la
visualizzazione e quantificazione della netosi. A tal scopo sono state utilizzate cellule
della linea HL60, cellule promielocitiche tumorali precursori dei neutrofili. Le cellule
sono state sottoposte a differenziamento verso il fenotipo dei neutrofili, che è stato
verificato tramite valutazione dell’espressione di una proteina di superficie cellulare, la
CD11b. È stata quindi indotta la netosi sulle cellule differenziate, sperimentando
protocolli diversi anche per favorirne l’adesione su vetrini adatti a misure di microscopia.
Dopodiché sono state eseguite varie analisi morfologiche tramite tecniche di
microscopia a fluorescenza, che ci hanno permesso di concludere quali fossero i
trattamenti utilizzati più efficienti per visualizzare il processo. Una ulteriore conferma dei risultati ottenuti ci è stata data dalla quantificazione fluorimetrica del DNA
extracellulare, che ci ha permesso di correlare l’aumento di fluorescenza sviluppata nei
vari campioni trattati con la formazione di NETs.
I dati ottenuti indicano che abbiamo ottenuto un saggio robusto e quantitativo, che
potrà in futuro essere usato sia per studiare i meccanismi molecolari delle diverse
patologie in cui la netosi è coinvolta, sia per potenzialmente identificare nuovi target
terapeutici.