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Tesi etd-11092016-123056


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
FALCO, ANTONINO
URN
etd-11092016-123056
Title
Validazione ed analisi di nuove variazioni geniche individuate tramite sequenziamento dell'intero esoma del carcinoma midollare della tiroide negativo per RET e RAS
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Commissione
relatore Prof.ssa Elisei, Rossella
relatore Dott. Ciampi, Raffaele
Parole chiave
  • carcinoma midollare della tiroide
  • next generation sequencing
  • validazione
  • MTC
  • sequenziamento
Data inizio appello
12/12/2016;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
12/12/2019
Riassunto analitico
Il carcinoma midollare della tiroide (MTC) deriva dalle cellule C parafollicolari e rappresenta circa il 7% dei tumori che colpiscono la tiroide. Il MTC si presenta in circa il 75% dei casi in forma sporadica e nel 25% in forma ereditaria: in quest’ultimo caso può presentarsi in associazione ad altre neoplasie endocrine configurando la Sindrome delle Neoplasie Endocrine Multiple (MEN) di tipo 2A e 2B, o come patologia isolata nel carcinoma midollare familiare (FMTC). Il protoncogene RET presenta mutazioni germinali in circa il 98% delle forme ereditarie di MTC e mutazioni somatiche in circa il 40% delle forme sporadiche; mutazioni somatiche nei geni H- e K-RAS sono presenti, in alternativa, in un altro 11% di casi sporadici. Circa il 2% delle forme ereditarie ed il 40% delle forme sporadiche rimangono tuttavia prive di un responsabile genetico. L’introduzione di tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) rappresenta uno strumento prezioso per scoprire nuove mutazioni alla base della fisiopatologia del cancro.
L’obiettivo di questa tesi è stato quello di validare ed analizzare nuove mutazioni puntiformi precedentemente individuate tramite sequenziamento dell’intero esoma (NGS) di 3 pazienti affetti da MTC sporadico ed 1 paziente affetto da FMTC. Tutti i casi risultavano negativi per la presenza di mutazioni nei geni RET e RAS.
In seguito ad un opportuno filtraggio dei dati ottenuti dal sequenziamento dell’esoma, abbiamo ottenuto una lista di 57 mutazioni presenti in altrettanti geni. Si tratta di mutazioni missenso in forma eterozigote o mutazioni mai riportate o, se presenti nei database dei polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) come dbSNP, ExAc, 1000genomes, caratterizzati da una frequenza allelica minima <0.01. Le mutazioni erano presenti in geni potenzialmente compatibili con la cancerogenesi e presentavano un alto valore di patogenicità come dimostrato dai test in silico.
Tutte le mutazioni ottenute mediante NGS sono state validate tramite sequenziamento Sanger del DNA genomico estratto dal sangue del paziente che presentava la mutazione sia per confermarne la presenza sia per valutarne l’eventuale origine germinale. I risultati ottenuti hanno validato la presenza di 53/57 (92.9%) mutazioni germinali mentre le rimanenti 4/57 (7.1%) non sono state confermate nemmeno dopo analisi su DNA estratto da tessuto tumorale per valutarne l’eventuale origine somatica, rappresentando perciò dei falsi positivi dell’NGS
Vista la natura germinale di tutte le mutazioni, si è posta l’attenzione alle 28 mutazioni presenti nel paziente affetto da FMTC analizzandole anche in altri due familiari: uno affetto ed uno sano, in modo da valutare l’eventuale segregazione di queste mutazioni con la malattia. Ciò ha messo in evidenza due rari SNP: rs372939895 nel gene KIAA1522 e rs760417150 nel gene REM1, presenti nei due soggetti affetti ma non in quello sano.
Alla luce di questi risultati abbiamo quindi ipotizzato un ruolo predisponente di questi SNP ed abbiamo valutato la loro presenza nel DNA genomico di 871 pazienti affetti da MTC sporadico mediante Real Time PCR, usando saggi TaqMan Custom SNP Genotyping appositamente disegnati e confrontando i dati con i controlli sani presenti nei database suddetti, ma non è stato rilevato nessun caso aggiuntivo.
In conclusione, in questo studio sono state validate il 92.9% delle 57 mutazioni ottenute dal sequenziamento dell’esoma di 4 casi di MTC. Tutte le mutazioni sono risultate germinali. SNP presenti su 2 geni, KIAA1522 e REM1 che segregavano con la malattia in una famiglia affetta da FMTC, sono stati analizzati in 871 casi di MTC ma senza nessun caso aggiuntivo. Pertanto si potrebbe ipotizzare che questi due rarissimi polimorfismi potrebbero identificare un genotipo “privato”, cioè ristretto ad un'unica famiglia, predisponente al MTC. Uno studio funzionale dei due SNP atto a valutare le capacità trasformanti e l’effettivo ruolo predisponente in questa famiglia rappresentano lo sviluppo futuro di questa tesi.
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