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Tesi etd-10272018-102457


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
ABRAMI, ELEONORA
URN
etd-10272018-102457
Title
Validazione di un saggio di immunoneutralizzazione e applicazione del test a plasmaderivati per valutarne la capacità anticorpo neutralizzante verso il Parvovirus umano B19.
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Commissione
relatore Prof. Pistello, Mauro
relatore Dott.ssa Bonci, Francesca
Parole chiave
  • validazione
  • immunoneutralizzazione
  • B19
  • plasmaderivati
Data inizio appello
10/12/2018;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
10/12/2021
Riassunto analitico
I farmaci plasmaderivati sono medicinali prodotti dalla lavorazione industriale del plasma, componente liquida del sangue. La loro sicurezza si basa su controlli effettuati sulla materia prima e sui processi stessi di lavorazione, che includono metodi di inattivazione e rimozione virale. Tra i plasmaderivati, il Plasma trattato Solvente/Detergente (S/D) è un farmaco utilizzato nei casi di terapia intensiva in pazienti con disordini ematici e difetti della coagulazione in quanto possiede un contenuto standardizzato di fattori della coagulazione e proteine plasmatiche. Esso origina da un pool di plasma che ha subito un trattamento con il detergente Octoxinolo e il solvente tri-(N-butil)-fosfato (TNBP). Il trattamento S/D, distruggendo i lipidi di membrana, è efficace nell’inattivazione dei virus con envelope, ma non ha effetti sui virus privi di involucro, come il virus dell’Epatite A (HAV), virus dell’Epatite E (HEV) e Parvovirus B19 (B19). La sicurezza del prodotto verso di essi è garantita attraverso misure di sicurezza prese per il controllo virale (screening NAT sulle donazioni singole e sui pool, selezione dei donatori, ricerca di marker virali etc.); in particolare, la sicurezza del prodotto per quanto riguarda il rischio di infezione da B19 è assicurata applicando il test NAT per il DNA di B19 sui pool di plasma, i quali sono scartati se contengono una carica virale maggiore di 10.0 IU/µl, limite definito dalla Farmacopea Europea. In aggiunta allo screening NAT, a dare un ulteriore contributo per la sicurezza dei plasmaderivati è la presenza di anticorpi neutralizzanti verso B19 nel prodotto finito; tuttavia attualmente non è richiesto un test di screening anticorpale sui Plasma S/D e non è definito un limite minimo di anticorpi in grado di neutralizzare il Parvovirus B19.
A tal fine in questa tesi sperimentale è stato pianificato di validare un metodo per stabilire la capacità neutralizzante del Plasma S/D verso il virus B19, trovando una correlazione tra anticorpi anti-B19 (misurati tramite ELISA) e titolo neutralizzante (misurato tramite saggio di infettività in vitro), con lo scopo di introdurre, come standard volontario, un limite minimo di anticorpi anti-B19 nel prodotto finito come test di rilascio.
Il test è un saggio di infettività in vitro applicato su 3 lotti di Plasma S/D contenenti concentrazioni decrescenti di anticorpi leganti anti-B19, alle quali vengono aggiunte concentrazioni seriali di Parvovirus B19. L’immunoneutralizzazione viene valutata attraverso l’infezione delle cellule suscettibili UT7/EpoS1, seguita dall’estrazione dell’mRNA virale e amplificazione tramite RT-PCR.
In base ai risultati ottenuti negli esperimenti di validazione del test, il metodo è risultato lineare, accurato, preciso, robusto e specifico. I risultati preliminari derivati dall’applicazione del metodo ai 3 lotti di Plasma S/D dimostrano una buona capacità neutralizzante degli anticorpi anti-B19 nei confronti del virus, anche a concentrazioni anticorpali ben al di sotto delle minime quantità rilevate nel prodotto finito.
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