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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

 

Tesi etd-09062010-162934


Tipo di tesi
Tesi di laurea specialistica
Autore
GUEYE, SOKHNA AISSATOU
URN
etd-09062010-162934
Titolo
Allestimento di un mutante nel gene ybjQ di Bacillus cereus e sua caratterizzazione fenotipica
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Commissione
relatore Prof.ssa Senesi, Sonia
relatore Prof.ssa Ghelardi, Emilia
correlatore Prof.ssa Tavanti, Arianna
correlatore Prof.ssa Batoni, Giovanna
Parole chiave
  • differenziamento swarming
  • swra
  • B. cereus
  • gene ybjQ
Data inizio appello
27/09/2010;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
27/09/2050
Riassunto analitico
Bacillus cereus è un microrganismo Gram-positivo, sporigeno che si comporta da patogeno/patogeno opportunista per l’uomo. In quanto dotato di flagelli disposti su tutta la superficie batterica, questo microrganismo è capace di muoversi in mezzo liquido mediante motilità swimming. Inoltre, quando propagato su superfici con una appropriata concentrazione di nutrienti e viscosità, B. cereus è in grado di muoversi mediante swarming. Lo swarming rappresenta un particolare tipo di motilità cooperativa che prevede un profondo processo differenziativo cellulare che porta alla produzione di cellule swarm, più lunghe e dotate di un maggior numero di flagelli rispetto alle forme planctoniche. Le cellule swarm di B. cereus sono caratterizzate dalla capacità di sintetizzare/secernere una maggiore quantità di fattori di virulenza e contribuiscono alla patogenicità di questo microrganismo.
Nonostante si ritenga che lo swarming rappresenti un fenomeno complesso che richiede l’alterata espressione di molti geni implicati in numerose funzioni cellulari, i meccanismi che portano alla produzione di cellule swarm in B. cereus rimangono quasi del tutto sconosciuti. In B. subtilis, la specie più studiata del genere Bacillus, è stato dimostrato che la proteina codificata dal gene swrA ha un ruolo importante nella regolazione del numero di flagelli ed è assolutamente necessario per il differenziamento swarming di questa specie batterica.
La presente tesi si è prefissa lo scopo di valutare se in B. cereus esistesse un gene omologo a swrA di B. subtilis e se tale gene, eventualmente presente, fosse coinvolto nel differenziamento swarming e/o nella motilità in mezzo liquido di questo microrganismo. Mediante un’approfondita analisi in silico è stata identificata una ORF, denominata ybjQ, mostrante un certo grado di omologia con swrA di B. subtilis. Al fine di generare un mutante mancante di ybjQ, sono stati disegnati dei primer per amplificare due regioni genomiche fiancheggianti il gene ybjQ e comprendenti una porzione ybjQ ciascuna. Gli amplificati di PCR sono stati clonati in opportuni vettori plasmidici e, successivamente, in un vettore shuttle capace di replicarsi sia nei microrganismi Gram-negativi che Gram-positivi. Nella miscela di ligazione è stato incluso anche un frammento di DNA, preparato mediante digestione di uno specifico plasmide con opportuni enzimi di restrizione, portante una “cassetta genica” capace di conferire resistenza alla kanamicina. Con il prodotto di ligazione sono state trasformate cellule di E. coli, dalle quali il plasmide ottenuto è stato purificato ed impiegato per trasformare B. cereus. I ceppi trasformanti di B. cereus sono stati curati dal plasmide facendo crescere i microrganismi a temperatura non permissiva per la replicazione del plasmide e selezionando con aggiunta di kanamicina al terreno di coltura. Ciò favoriva la selezione di ceppi di B. cereus in cui fosse avvenuta ricombinazione tra la porzione genomica portante il gene ybjQ integro e la stessa porzione presente nel plasmide portante il gene ybjQ interrotto dalla “cassetta genica”. Mediante questi esperimenti è stato ottenuto un ceppo di B. cereus mutante nel gene ybjQ. E’ stata, quindi, effettuata una indagine comparativa per valutare quali difetti fenotipici potessero essere presenti nel ceppo mutante rispetto al ceppo parentale. In particolare è stato valutato: la velocità di crescita in diversi terreni, la motilità cellulare in mezzo liquido, la quantità di flagelli prodotti sia in mezzo liquido che su terreno solido, la lunghezza cellulare e il profilo delle proteine totali di secrezione e di quelle citoplasmatiche.
I risultati finora ottenuti indicano che vi sono profonde differenze tra le funzioni che i geni ybjQ e swrA esercitano rispettivamente in B. cereus e in B. subtilis e che il gene ybjQ non sembra avere un ruolo significativo nella motilità e nel differenziamento swarming di B. cereus.
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