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Tesi etd-08182016-163815


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
AGNARELLI, ALESSANDRO
URN
etd-08182016-163815
Titolo
Effetti indotti dall'alcaloide naturale berberina in tre diverse linee cellulari umane
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Commissione
relatore Dott.ssa Marracci, Silvia
Parole chiave
  • senescenza
  • senescence
  • nutraceutici
  • nutraceuticals
  • metastasis
  • metastasi
  • berberine
  • berberina
  • autophagy
  • autofagia
  • apoptosis
  • apoptosi
Data inizio appello
26/09/2016;
Disponibilità
parziale
Riassunto analitico

La berberina è un alcaloide isochinolico di origine naturale estratto da specie vegetali come Berberis aristata e Berberis vulgaris. Questo alcaloide ha una varietà di attività farmacologiche senza significativi effetti collaterali. Recenti studi indicano che la berberina ha proprietà antineoplastiche agendo a diversi livelli della tumorigenesi quali sopravvivenza, proliferazione e migrazione cellulare.
Il mio lavoro di tesi, svolto presso l’Unità di Biologia Cellulare dell’ Università di Pisa, analizza come differenti linee cellulari rispondono al trattamento con berberina. In particolare, ho utilizzato la linea cellulare MIA PaCa-2 di carcinoma pancreatico e la linea cellulare U343 di glioblastoma; come controllo non tumorale ho utilizzato la linea cellulare primaria HDF (Human Dermal Fibroblasts). Poichè la berberina emette luce fluorescente verde quando esposta a luce UV, ho visualizzato come differenti concentrazioni di berberina si localizzano all’interno dei tre tipi cellulari. Ho osservato che la berberina è presente nel citoplasma e/o nel nucleo in modo dose-dipendente. Allo scopo di valutare se la berberina abbia un effetto differenziale sulla vitalità delle cellule tumorali, ho effettuato una conta cellulare con il test di esclusione al colorante Trypan Blue. Ho osservato che pur essendo presente una diminuzione della vitalità in tutti e tre i tipi cellulari, il calo di vitalità è più consistente nelle cellule tumorali. Utilizzando il TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester), marcatore del potenziale redox di membrana del mitocondrio, ho anche analizzato se la berberina causi stress mitocondriale. E’ risultato che i trattamenti con berberina provocano una riduzione del segnale del TMRM indicando un decadimento dell’attività mitocondriale in tutti e tre i tipi cellulari. E’ interessante notare come la riduzione del segnale del TMRM sia maggiore nelle due linee tumorali, suggerendo quindi una selettiva azione citotossica della berberina sul mitocondrio di queste cellule. Per comprendere quale tipo di morte cellulare venga indotto dalla berberina ho analizzato lo stato di apoptosi, di senescenza cellulare e di autofagia nelle cellule trattate con berberina. Per studiare se sia coinvolto il meccanismo di morte apoptotica ho analizzato l’attività dell’enzima CASPASI-3. Il risultato di questi esperimenti dimostra che in cellule HDF il trattamento con berberina 10 μM induce attivazione della CASPASI-3, mentre è necessaria una elevata concentrazione di berberina (150 μM) per indurre l’attivazione della CASPASI-3 nelle due linee tumorali. La senescenza cellulare, analizzata mediante il saggio della β-galattosidasi, dimostra che la berberina aumenta i livelli di senescenza in tutti e tre tipi cellulari in maniera dose-dipendente e in maniera preferenziale nelle cellule tumorali MIA PaCa-2 rispetto alle non tumorali HDF. Infine la lettura al citofluorimetro del segnale emesso dal marcatore autofagico Acridina Orange, ha evidenziato che la berberina induce anche autofagia nelle cellule tumorali, ma non nelle cellule HDF. Poichè la berberina entra nel nucleo, ho valutato se essa possa agire a livello trascrizionale interferendo con l’espressione di geni correlati con processi importanti per la carcinogenesi. Ho quindi analizzato, tramite real-time RT PCR, i livelli di espressione genica di vari marcatori molecolari. In particolare ho analizzato l’espressione dei geni DNMT1, DNMT3A, DNMT3B e MGMT coinvolti nei pathway epigenetici, dei geni P53, P21, P14, P16, e CASP-3 coinvolti nei pathway di senescenza cellulare e apoptotici e dei geni PTEN, BECN-1 e LC3II coinvolti nel pathway autofagico. I risultati dimostrano che l’azione della berberina a livello trascrizionale è diversa nei tre tipi cellulari analizzati. Ho infine valutato se la berberina interferisca con la capacità di migrazione delle cellule tumorali MIA PaCa-2 mediante il saggio del “wound healing”. E’ risultato che la berberina rallenta la migrazione delle cellule MIA PaCa-2 in maniera dose-dipendente. Gli esperimenti di real-time RT PCR mostrano un calo dei livelli di espressione di CXCR4, un gene che svolge un importante ruolo nella migrazione cellulare, nelle cellule MIA PaCa-2 trattate con berberina rispetto al controllo.
In conclusione questi risultati dimostrano che la berberina induce maggiori effetti citotossici nelle cellule tumorali rispetto alle cellule non tumorali HDF. Inoltre la risposta al trattamento con la berberina è linea cellulare-specifica. Queste caratteristiche rendono sicuramente vario e non specifico l’effetto di questo alcaloide. Disporre di nuove informazioni circa i meccanismi anti-tumorali attraverso i quali la berberina agisce su specifiche popolazioni tumorali, è sicuramente importante per evitare possibili interazioni negative della berberina con i chemioterapici e per favorire invece interazioni che potenzino in modo sinergico gli effetti anti-tumorali dei farmaci stessi.‏

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