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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

 

Tesi etd-07032012-140055


Tipo di tesi
Tesi di specializzazione
Autore
GALLEGGIANTE CRISAFULLI, ANNAMARIA
URN
etd-07032012-140055
Titolo
Studio della variabilita del gene caprino CCR5: analisi propedeutica all'individuazione di polimorfismi coinvolti nella resistenza alle lentivirosi (CAEV)
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
BIOCHIMICA CLINICA
Commissione
relatore Prof. Lucacchini, Antonio
Parole chiave
  • polimorfismi
  • Lentivirus
  • capra
  • gene CCR5
Data inizio appello
26/07/2012;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Il virus Maedi Visna (MVV) e il virus dell’Artrite-Encefalite caprina (CAEV) determinano una malattia virale contagiosa tipica di ovini e caprini; appartengono alla famiglia Retroviridae, genere Lentivirus, a cui è ascrivibile anche il virus dell’immunodeficienza acquisita dell’uomo (HIV).
A fronte della grave situazione determinata da un’elevata percentuale di capi positivi alla CAEV e all’inesistenza di un trattamento terapeutico efficace, l’unica strategia di lotta, attualmente, è stata l’attuazione di piani di eradicazione volontaria.
Tale approccio però si è rivelato inefficace, pertanto una via alternativa verso la quale si stanno orientando i recenti studi, risulta essere costituita dalla ricerca di marcatori genetici di resistenza alla malattia.
Ampie prospettive sono state aperte da studi condotti sia nell’uomo che negli ovini che hanno evidenziato la presenza di mutazioni coinvolte nella modulazione della suscettibilità alle lentivirosi.
Nell’uomo, il gene CCR5 codificante per una proteina di membrana con funzione di recettore per le chemochine, è stato descritto come marcatore genetico coinvolto nella resistenza all’infezione da HIV-1.
Un recente studio condotto sugli ovini ha messo in evidenza una delezione di 4 pb nella regione del promotore di CCR5 (5436-5439) che determina un’alterazione dei siti di legame per fattori trascrizionali riducendo, in ovini omozigoti deleti, fino a 3.9 volte l’espressione di tale recettore e dimezzando la carica provirale.
Questo lavoro, partendo dal contesto suddetto, ha lo scopo di indagare per la prima volta la sequenza del gene CCR5 nella capra ed il ruolo dei polimorfismi ad esso associati nella modulazione della suscettibilità/resistenza all’infezione da CAEV, al fine di porre le basi per l’allestimento in futuro di piani di selezione assistita da marcatori.
A tale scopo, sono stati analizzati 20 campioni di sangue appartenenti a caprini di razza Camosciata. Gli animali sono stati scelti di differente età, non imparentati tra di loro e con una ratio tra i sessi di 1:1. E’ stato estratto il DNA, il gene CCR5 è stato analizzato mediante quattro PCR comprendenti la regione del promotore, Esone 1, Introne, Esone 2 comprendente il CDS, regione 3’ UTR. Ciascun amplificato è stato sottoposto a sequenziamento e le sequenze ottenute sono state analizzate mediante il Software Seqman. Gli aplotipi più probabili sono stati definiti attraverso l’applicazione del software PHASE (v 2.1.1).
È stata inoltre condotta un’analisi funzionale dei polimorfismi rilevati nelle differenti regioni geniche utilizzando a tale scopo differenti software: TFSEARCH per individuare eventuali punti di interazione con fattori di trascrizione; UTRScan per rilevare l’eventuale presenza di siti polimorfici all’interno di consensus motifs; Rescue-ESE Web Server per valutare se i polimorfismi rilevati appartenessero a motivi regolatori collocati a livello esonico.
Sono stati individuati 17 alleli, risultati tutti in equilibrio di Hardy-Weinberg, associati a costituire 5 aplotipi.
Sei alleli, uno dei quali caratterizzato dall’inserzione di 2 basi TC, si localizzano all’interno del promotore, 6 nell’introne tra esone 1 e 2,4 nella regione 3’ UTR ed è stata invece rilevata la mutazione puntiforme in posizione 8121 codificante per la sostituzione aminoacidica I198T.
Successivamente è stata eseguita un’analisi funzionale dei polimorfismi mediante software dedicati, che ha permesso di definirne il ruolo svolto.
La mutazione puntiforme in posizione 8121 T>C codifica per la sostituzione aminoacidica I198T, dando luogo ad una sostituzione neutrale.
I risultati ottenuti hanno evidenziato che il CCR5 caprino è moderatamente polimorfo e per quanto concerne le mutazioni descritte nel promotore, potrebbero avere un ruolo rilevante quelle ubicate entro le 500 pb dal Transcriptional Start Site (TSS) in quanto dati bibliografici riportano che un terzo di esse interferisce per più del 50% sui livelli di trascrizione.
Questo consentirà di effettuare un studio caso-controllo per scoprire eventuali associazioni tra gli aplotipi rilevati e la resistenza a CAEV nei caprini.

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