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Tesi etd-03152016-132541


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
AGOSTA, VITALBA
URN
etd-03152016-132541
Titolo
Modulazione dell'espressione genica e della capacita' antiossidante in ratti maschi adulti sottoposti ad esercizio fisico prolungato
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Commissione
relatore Dott.ssa Scuri, Rossana
Parole chiave
  • TOSCA
  • attività antiossidante
  • sirtuine
  • ratto adulto
  • esercizio fisico
Data inizio appello
11/04/2016;
Disponibilità
completa
Riassunto analitico
L’ipotesi che l’esercizio fisico rappresenti un fattore di protezione per l’intero organismo oggi non è più un’ipotesi. Le evidenze scientifiche hanno ormai chiarito che l’attività fisica, moderata e costante nel tempo, induce benefici energetici, biochimici e fisiologici, migliorando la qualità della vita e il benessere globale della persona. Questi effetti benefici hanno una valenza maggiore, se a sottoporsi ad attività fisica, è un anziano. Inoltre, sembra che l’attività fisica, praticata da soggetti adulti, combatta gli effetti dell’invecchiamento e ne ritardi i sintomi, limitando i danni legati allo stress ossidativo per aumento delle capacità antiossidanti delle cellule “adulte”.
Il legame meccanicistico tra esercizio fisico e invecchiamento è stato sconosciuto fino agli anni 50. Nel 1957 Harman ipotizzò che la causa della senescenza cellulare fosse un lento spegnimento dell’attività mitocondriale, che, con il procedere degli anni, determina un accumulo di radicali liberi e una ridotta capacità antiossidante, portando la cellula ad apoptosi. Sulla base di questa teoria, successivi studi su modelli animali adulti, sottoposti ad esercizio fisico, hanno valutato una correlazione tra l’attività fisica e l’allungamento della durata della vita, grazie ad una riduzione dello stress ossidativo. Ciò sembra dovuto all’attività deacetilasica di specifiche proteine NAD+-dipendenti, quali le sirtuine. Il significativo interesse rivolto al ruolo delle sirtuine, come proteine antinvecchiamento, ha portato i ricercatori a valutare inizialmente i meccanismi biochimico-molecolari che vedono coinvolte queste importanti deacetilasi. È stato così chiarito come l’esercizio fisico attivi le sirtuine, aumentando i livelli di molecole di NAD+-disponibili; una volta attivate, le sirtuine, mediante la deacetilazione di specifiche molecole bersaglio, oltre che gestire importanti processi metabolici cellulari, aumentano l’attività dei sistemi scavenger della cellula (SOD2, catalasi, glutatione perossidasi, MnSOD) e favoriscono la biogenesi mitocondriale PGC1α-mediata. L’invecchiamento cellulare, di contro, incide negativamente sull’attività delle sirtuine, per sottrazione delle molecole di NAD+ a favore dell’attività di riparazione dei danni al DNA PARP-mediati. Dunque l’esercizio fisico e i processi di senescenza cellulare regolano l’attività delle sirtuine a valle; ciò che è ancora poco chiaro è se modulino l’espressione genica di queste proteine. Scopo della presente tesi è stato quello di capire se la maggiore attivazione delle sirtuine, a seguito di attività fisica, dipenda da un incremento della loro espressione genica e/o proteica, o da un aumento della loro attività deacetilasica per incremento di NAD+. È stata dunque valutata l’espressione genica della sirtuina 1 e della sirtuina 3 in vari tessuti ottenuti da ratti maschi adulti sottoposti ad esercizio fisico prolungato e costante, e da ratti maschi adulti sedentari; inoltre è stata avviata la misurazione della capacità antiossidante nei tessuti dei ratti allenati per valutare eventuali differenze rispetto ai sedentari.
Sono stati utilizzati 8 ratti maschi del ceppo Wistar di 3/5 mesi, casualmente divisi in due gruppi: 5 allenati e 3 sedentari. È stato ideato un protocollo di allenamento, della durata complessiva di 6 settimane, che consisteva di 3 sedute a settimana in cui l’animale, singolarmente, veniva costretto a seguire camminando il movimento rotatorio di una ruota motorizzata. Ciascuna sessione di allenamento prevedeva 30 minuti di movimento, e la velocità di rotazione della ruota subiva un incremento di 1m/min, ogni 15 minuti, sessione dopo sessione, in modo che i ratti progressivamente percorrevano distanze maggiori. I sedentari, invece, venivano portati nella stanza di allenamento insieme ai ratti trattati ma venivano lasciati nella loro gabbia di stabulazione per tutta la durata dell’allenamento. Una settimana dopo il termine dell’allenamento i ratti sono stati sacrificati e da essi sono stati ottenuti campioni di tessuto cardiaco, tessuto muscolare (muscolo gastrocnemio), tessuto epatico, e porzioni di tessuto cerebrale comprendenti principalmente l’ippocampo. La metà dei campioni ottenuti è stata immediatamente omogenizzata, frazionata e stoccata a -80°C per essere successivamente utilizzata nell’analisi TOSCA (Total Oxyradical Scavenging Capacity Assay). L’altra metà dei campioni è stata conservata a -80°C e utilizzata per l’analisi trascrizionale: estratto l’RNA, è stata effettuata una qRT-PCR real time su tutti i campioni, per valutare i cambiamenti d’espressione dei geni sirt1, sirt3 e del gene che codifica per NGF (valutato solo nell’ippocampo). Mediante il metodo del 2-ΔΔCT, i livelli di espressione di ciascun gene target sono stati normalizzati rispetto ai geni house-keeping (gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi e β-actina) e l’incremento o il decremento di espressione è stato determinato in rapporto al controllo rappresentato dai campioni prelevati dai ratti sedentari.
I risultati ottenuti mediante l’analisi trascrizionale mostrano come l’attività fisica a cui sono stati sottoposti i 5 ratti sperimentali abbia determinato un aumento significativo dell’espressione genica di sirt1 a livello cardiaco, e del gene per la neurotrofina NGF a livello ippocampale. Negli altri tessuti non è stata osservata alcuna alterazione dei livelli di espressione nei ratti allenati rispetto ai sedentari.
I risultati ottenuti dall’analisi TOSCA, al momento condotta solo sui campioni di ippocampo, hanno mostrato un aumento di attività antiossidante specifica sia nei confronti dei radicali perossilici, idrossilici e dei derivati della perossinitrite nei ratti allenati, rispetto a quella osservata nei sedentari.
Di particolare interesse è l’incremento dell’attività antiossidante nei confronti dei radicali idrossilici, osservato nei ratti allenati, data la loro caratteristica eccessiva tossicità e reattività. L’organismo li contrasta solo parzialmente e dall’esperienza clinica sembra che gli antiossidanti disponibili in commercio abbiano scarsa efficacia nei confronti di questa specie radicalica; pertanto assume particolare importanza il fatto che un’attività fisica moderata e costante sviluppi una buona attività antiossidante proprio nei confronti dei radicali idrossilici.
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