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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

 

Tesi etd-02122014-151451


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
GIUNTINI, SIMONA
URN
etd-02122014-151451
Titolo
Messa a punto di un metodo di purificazione di fattore H da plasma umano finalizzato all'ottenimento di un concentrato per il trattamento di malattie rare associate a difetti congeniti della via alternativa del complemento.
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI E INDUSTRIALI
Commissione
relatore Del Corso, Antonella
relatore Lazzarotti, Alessandra
Parole chiave
  • orphan drug
  • purificazione
  • complemento
  • fattore H
Data inizio appello
03/03/2014;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Il fattore H (fH) è una glicoproteina plasmatica di 155 KDa, che gioca un ruolo fondamentale nella regolazione della via alternativa del complemento e possiede proprietà anti-infiammatorie: previene il legame del fattore B al C3b, promuove la dissociazione del complesso enzimatico C3bBb e agisce come cofattore del fattore I nel clivaggio del C3b.
In questa tesi è descritta la messa a punto di un metodo di purificazione del fH umano, a partire da un intermedio (frazione III) derivante dal frazionamento etanolico del plasma, finalizzato all’ottenimento di un concentrato arricchito di tale glicoproteina da utilizzare nel trattamento di patologie rare associate a difetti ereditari del sistema del complemento, quali la Sindrome Emolitico Uremica atipica e la Glomerulonefrite Membranoproliferativa di tipo II.
Il metodo di purificazione delineato include: l’estrazione del fH dalla frazione III, una filtrazione di profondità, una filtrazione chiarificante, uno step di trattamento con miscela solvente/detergente per l’inattivazione dei virus envelope, due step di separazione cromatografica a cui fa seguito uno step di nanofiltrazione per la rimozione dei virus envelope e non envelope.
Il primo step cromatografico è condotto utilizzando uno scambiatore anionico debole mentre nel secondo step è utilizzata una resina di affinità avente come ligando l’eparina.
Il concentrato di fattore H così ottenuto ha un buon grado di purezza ed è stato caratterizzato mediante SDS-PAGE per valutarne l’integrità strutturale nonché evidenziare le proteine contaminanti e mediante Western-blotting per confermare l’identità della proteina.
La funzionalità della proteina è stata valutata mediante il dosaggio del cofattore, tuttora in fase di ottimizzazione, che permette di testare la sua funzione come cofattore del fattore I.
Le proteine contaminanti sono state identificate mediante analisi nefelometriche e mediante analisi proteomica.
Sebbene il processo sia ancora passibile di miglioramenti, il lavoro sperimentale ha condotto alla messa a punto di un metodo di purificazione del fattore H semplice, scalabile e idoneo all’ottenimento di un concentrato utilizzabile nel trattamento della Sindrome Emolitico Uremica atipica e della Glomerulonefrite Membranoproliferativa di tipo II.

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