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Tesi etd-02102015-173210


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
FANTINI, MARIO
URN
etd-02102015-173210
Title
Caratterizzazione della gamma-glutammiltransferasi circolante e delle relative frazioni durante il follow-up post-trapianto di fegato
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Commissione
relatore Dott.ssa Franzini, Maria
relatore Prof. Paolicchi, Aldo
Parole chiave
  • frazioni
  • gammaglutammiltransferasi
  • caratterizzazione
  • followup
  • trapianto
  • fegato
Data inizio appello
02/03/2015;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
La γ-glutamiltransferasi (GGT) è un enzima evolutivamente conservato, in grado di catalizzare specificamente la scissione del legame γ-glutamilico del glutatione (GSH) ed, inoltre, il trasferimento del gruppo γ-glutamile all’acqua (idrolisi), ad amminoacidi o a peptidi (transpeptidazione). La GGT ha un ruolo centrale nel metabolismo del glutatione e nel ciclo del γ-glutamile, che comprende la sintesi e la degradazione del glutatione. L’enzima è localizzato sulla superficie esterna della membrana plasmatica e per tale motivo si ritiene che esso abbia un ruolo chiave nella captazione, da parte delle cellule, dei precursori per la sintesi del glutatione intracellulare. Il dosaggio della GGT, spesso richiesto negli esami di laboratorio di routine, è utilizzato nello screening e nel trattamento delle patologie del fegato e delle vie biliari, in quanto un suo innalzamento è stato osservato in vari disturbi, quali cirrosi, colestasi, steatosi, ma anche in epatopatie virali e in tumori primari e secondari. Le concentrazioni di GGT nel plasma sembrano dipendere principalmente dalla funzionalità del sistema epatobiliare, pur essendo l’enzima riscontrabile nelle membrane cellulari di moltissimi tessuti (tra cui rene, pancreas, milza, cuore); per tal motivo alti livelli di GGT nel sangue sono comunemente associati a tutte le malattie a carico del fegato e delle vie biliari. Nel 1981 Huseby e collaboratori hanno fornito una prova sull’origine prevalentemente epatica della GGT sierica, dimostrando nei loro studi l’identità di caratteristiche chimico-fisiche tra la GGT estratta dal fegato e la GGT sierica. Per quanto nessuno neghi l’importanza del dosaggio sierico della GGT, la sua rilevanza viene diminuita dal fatto che, pur essendo un test particolarmente sensibile, esso è scarsamente specifico, dal momento che diversi fattori sia genetici, sia ambientali, come ad esempio genere, età, ipertensione, colesterolemia, trigliceridemia, glicemia, impiego di contraccettivi orali, abitudini al fumo ed attività fisica, ne influenzano i valori.
In diversi studi è stata messa in evidenza l’eterogeneità della GGT sierica, difatti sono presenti diverse forme di GGT con caratteristiche chimico-fisiche diverse, non ancora ben definite. Nel laboratorio in cui sono state elaborate le procedure per ottenere i risultati utilizzati nella presente tesi, è stata messa a punto una tecnica che, tramite cromatografia per esclusione molecolare, permette di separare quattro frazioni di GGT plasmatica ed ,in modo sensibile e selettivo, di rilevarne l’attività mediante una reazione enzimatica post-colonna. Sono stati identificati tre complessi ad alto peso molecolare dotati di attività enzimatica e sono stati denominati in base al rispettivo peso molecolare, pertanto si hanno le frazioni: big-GGT (b-GGT; 2000 kDa), medium-GGT (m-GGT; 940 kda), small-GGT (s-GGT; 140 kda); la quarta frazione identificata, free-GGT (f-GGT; 70kda), ha un peso molecolare compatibile con l’enzima libero. L’elaborazione della tecnica mira ad approfondire lo studio della natura dei complessi coinvolti nel trasporto della GGT nel plasma e nella bile. I dati ottenuti su plasma, relativi alle caratteristiche chimico-fisiche, alla suscettibilità a detergenti e all’azione proteolitica della papaina, fanno ipotizzare che la b-GGT possa essere inclusa in microvescicole di membrana (dette esosomi), la m-GGT e la s-GGT presentino, invece, un comportamento compatibile con la presenza in micelle di acidi biliari, ed infine, la f-GGT sia una forma solubile dell’enzima, priva del peptide idrofobico N-terminale.
Negli ultimi tempi è emerso che la ricerca e l’analisi delle frazioni della GGT costituiscono un utile biomarcatore per la diagnosi della steatosi epatica non-alcol correlata (NAFLD), in cui si riscontra un aumento di GGT sierica dovuta all’aumento della frazioni di b-GGT e in minor misura di s-GGT. La frazione s-GGT, invece, mostra un prominente incremento in soggetti affetti da epatocarcinoma (CHC) ed epatite virale (HCV), in questi ultimi non si registra un concomitante aumento significativo della frazione b-GGT, con conseguente diminuzione del rapporto b-GGT/s-GGT (b/s). La s-GGT sembra pertanto essere un buon biomarcatore di danno epatocellulare e colestatico, difatti è associata positivamente con le transaminasi AST e ALT, la bilirubina e la fosfatasi alcalina; per cui la frazione dell’s-GGT e il rapporto b/s risultano essere altamente specifiche per la diagnosi differenziale tra NAFLD e CHC. In soggetti alcolisti sottoposti ad un periodo di astinenza, il rapporto b/s è stato un sensibile biomarcatore per il danno epatico persistente; in aggiunta, i livelli di m-GGT ed s-GGT sono rimasti costantemente elevati rispetto al valore di GGT totale e delle frazioni b-GGT e f-GGT. Pertanto, l’analisi delle singole frazioni può essere utilizzata per il monitoraggio di soggetti alcolisti in astinenza, rispetto ai valori di GGT totale. Ne consegue che la giusta interpretazione del valore prognostico ed anche del valore diagnostico di ciascuna frazione della GGT, possa migliorare ed anche facilitare la comprensione dei meccanismi patogenetici delle malattie associati all’incremento del suddetto enzima.
Il proposito di tale elaborato è lo studio delle frazioni di GGT in campioni di plasma, prelevato da pazienti sottoposti a trapianto ortopico di fegato (OLT). I risultati ottenuti dall’analisi delle frazioni di GGT nei campioni di plasma, sono stati confrontati con i risultati dell’analisi delle frazioni di GGT in campioni di bile, appartenenti, sia i campioni di bile che di plasma, agli stessi pazienti sottoposti ad OLT. Nello stesso laboratorio, in tempi precedenti, sono state effettuate le analisi sui campioni di bile, prelevati dai pazienti nel post-trapianto grazie ad un drenaggio (Tubo di Kehr) posizionato nel coledoco, con lo scopo di facilitare il deflusso della bile e allo stesso tempo un’ottima cicatrizzazione del coledoco stesso in questi pazienti, pertanto, la raccolta dei campioni di bile è una procedura totalmente non invasiva. I campioni di bile e di plasma del nostro gruppo di pazienti sottoposti a OLT, sono stati prelevati, in corso di ricovero, nelle prime due settimane post operatorie, durante il follow-up precoce nel post-trapianto di fegato.
Il periodo peri-operatorio nel trapianto di fegato è senza dubbio il momento più critico per la buona riuscita dell’intervento stesso. Le variabili che possono influire positivamente o negativamente sono molteplici e possono interagire tra loro in maniera non facilmente prevedibile. Dall’1 al 5% degli organi trapiantati sono soggetti a disfunzione primaria (Primary Non Function, PNF) e sino al 20% hanno una ripresa ritardata (Delayed Graft Function, GDF). Nel primo caso il decesso del ricevente è inevitabile in assenza di un ritrapianto, nel secondo il rischio di morbidità e mortalità è estremamente più elevato. Questi fenomeni sono frequentemente riconducibili a danni da ischemia e riperfusione dell’organo, processi inevitabili che avvengono durante le procedure di prelievo e nel successivo trapianto. Un monitoraggio attento della funzione d’organo nel periodo intra-, peri-, e post-operatorio è fondamentale per ottimizzare la ripresa del trapianto, permettendo di intervenire con tempestività e appropriatezza nelle diverse situazioni cliniche. L’analisi dei biomarcatori come indici di funzione epatica e delle frazioni di GGT si può ipotizzare possano contribuire a valutare il danno subito dall’organo trapiantato.
Le analisi effettuate mediante cromatografia per esclusione molecolare hanno dimostrato che il profilo di eluizione della GGT sierica risulta costante per le frazioni b-GGT ed f-GGT, mentre risulta variabile per le frazioni f-GGT ed s-GGT.
In questo elaborato sono stati utilizzati i campioni di plasma raccolti da pazienti sottoposti a OLT, i prelievi sono stati effettuati durante i primi 15 giorni post-trapianto. I valori medi di GGT plasmatica totale nei primi 15 giorni presentano un’alta variabilità interindividuale con un picco al settimo giorno con un valore medio maggiore di 230U/L e successivamente tali valori tendono lentamente a diminuire. Anche per le frazioni b-GGT ed m-GGT possiamo notare un picco al settimo giorno, con successiva tendenza a diminuire nei giorni seguenti. Per le frazioni s-GGT ed f-GGT non è stato possibile delineare uno schema temporale che possa dare una visione d’insieme dell’andamento dell’attività media delle suddette frazioni nei primi 15 giorni post-trapianto.
I risultati, derivanti dall’analisi dei suddetti campioni, sono stati confrontati con i risultati ottenuti dall’analisi di campioni di bile prelevati anch’essi nello stesso arco temporale ed anch’essi aventi come oggetto l’indagine delle varie frazioni di GGT, dapprima osservando l’andamento di entrambe le forme, biliare e plasmatica, e dopo analizzando i valori medi mediate programma informatico. Non è presente correlazione tra gli andamenti della GGT biliare e plasmatica.
In conclusione, i dati raccolti dall’analisi delle frazioni plasmatiche di GGT, confrontati con i dati forniti dall’analisi delle frazioni biliari dell’enzima, in pazienti sottoposti a trapianto di fegato, sono stati incrociati con i dati emato-chimici di ogni paziente. L’analisi di correlazione ha mostrato correlazione significativa tra l’attività della GGT totale plasmatica e delle relativa frazioni plasmatiche con la bilirubina totale, le frazioni b-GGT ed m-GGT con valore positivo, mentre per le frazioni s-GGT ed f-GGT con valore negativo. L’analisi ha mostrato ulteriore correlazione significativa con i valori di ALP per tutte le frazioni di GGT e con i valori relativi a monociti, eosinofili e basofili per le frazioni b-GGT ed m-GGT.
Non è emersa alcuna correlazione tra i valori di GGT totale biliare e i valori emato-chimici dei pazienti; tale risultato è stato ottenuto anche per l’analisi di correlazione tra i valori della frazione b-GGT e i valori emato-chimici dei pazienti.
Il lavoro svolto nella seguente tesi indica come il significato della GGT circolante non possa essere circoscritto solamente ad un ruolo di indicatore di danno epatico, ma i dati raccolti suggeriscono che lo studio sul suo significato diagnostico debba essere ampliato e l’analisi delle sue frazioni potrebbe essere un valido strumento per raggiungere tale obiettivo.
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