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Tesi etd-11252008-205817


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
RUGANI, CHIARA
URN
etd-11252008-205817
Title
Ruolo di varianti missenso del gene BRCA1 nella riparazione del danno al DNA
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Supervisors
Relatore Caligo, Maria Adelaide
Relatore Bevilacqua, Generoso
Parole chiave
  • mutazioni
  • DSBs
  • HR
  • NHEJ
Data inizio appello
15/12/2008;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
15/12/2048
Riassunto analitico
RIASSUNTO

BRCA1 (Breast Cancer Gene 1) è un gene di suscettibilità al carcinoma mammario e ovarico umano. Mutazioni nonsenso o frameshift che producono un codone di stop prematuro ed una proteina BRCA1 tronca e mutazioni missenso che causano cambiamenti amminoacidici deleteri, predispongono allo sviluppo del tumore della mammella e dell’ovaio. D’altra parte non è ancora stato chiarito il ruolo patologico di molte varianti missenso ricorrenti in famiglie con storia di tumore alla mammella e all’ovaio. Un metodo per caratterizzarle è quello di valutare l’effetto della proteina variante rispetto alla forma wildtype nelle funzioni biologiche che BRCA1 svolge tramite saggi funzionali.
BRCA1 mappa in posizione 17q21 e codifica per una proteina nucleare che agisce da soppressore tumorale. Questa proteina è lunga 1863 amminoacidi e presenta differenti domini funzionali, che, attraverso l’interazione con partner specifici sono coinvolti nella regolazione della trascrizione, nel controllo del ciclo cellulare, nel pathway di ubiquitinazzione delle proteine e nel mantenimento della stabilità genomica mediante riparazione del danno al DNA tramite ricombinazione omologa (Homologous Recombination, HR) e mediante ricombinazione non omologa o (Non Homologous End Joining, NHEJ).
Lo scopo del lavoro di tesi è stato quello di valutare il potenziale ruolo patogenetico di varianti missenso (UCVs) del gene BRCA1 identificate in individui con storia familiare di cancro alla mammella e all’ovaio. In particolare è stato valutato l’effetto dell’overespressione di BRCA1 wt e delle forme varianti sul meccanismo di ricombinazione omologa (error-free) e non omologa (error-prone).
A tal fine sono state utilizzate due strategie sperimentali:
1. Per valutare il ruolo di BRCA1 wt e mutato nel pathway della ricombinazione omologa sono state utlizzate cellule della linea HeLaG1, un clone cellulare derivato dalla linea HeLa che ha un substrato di ricombinazione integrato nel proprio genoma. Il substrato contiene due geni di resistenza all’igromicina difettivi per l’inserzione di una sequenza linker. Come prodotto dell’evento di ricombinazione omologa si ottiene la formazione di un gene di resistenza all’igromicina attivo, che permette la selezione dei ricombinanti. In questo modo è stata valutata la capacità delle cellule di formare colonie in igromicina e calcolata la frequenza di ricombinazione omologa come rapporto delle colonie di cellule resistenti all’antibiotico per l’avvenuta integrazione del plasmide, rispetto al totale delle cellule vitali piastrate. L’effettiva espressione della proteina BRCA1 wt e mutata è stata valutata mediante la tecnica del Western Blot utilizzando l’anticorpo Ab-4 specifico per l’esone centrale della proteina in questione.
2. Per valutare la NHEJ si è ricorsi al metodo di valutazione della integrazione random nel genoma di una cellula umana di sequenze di DNA plasmidico. Il saggio si basa sulla trasfezione del vettore pBlue-puro il quale contiene un gene di resistenza ad un antibiotico sotto il controllo di un forte promotore virale e sequenze non omologhe alle sequenze umane. La non omologia di sequenza consente solo l’integrazione random del plasmide nel genoma delle cellule trasfettate per NHEJ. Questo saggio permette di valutare la frequenza dell’evento di NHEJ come rapporto delle colonie di cellule resistenti all’antibiotico per l’avvenuta integrazione del plasmide, rispetto al totale delle cellule vitali piastrate. Il saggio è stato effettuato nella linea epiteliale HeLa derivata da un carcinoma della cervice uterina. La linea esprime una forma wt della proteina BRCA1. E’ stata effettuata una co-trasfezione transiente di un vettore di espressione per il gene BRCA1 wildtype o mutato, con il plasmide pBLue-puro ed è stata valutata la capacità delle cellule di formare colonie in puromicina. Inoltre è stata valutata l’espressione del transgene BRCA1 wt e mutato mediante la tecnica del Western Blot, utilizzando lo stesso anticorpo precedentemente indicato.
I risultati ottenuti possono fornire delle valide indicazioni sul potenziale ruolo di BRCA1 e delle varianti missenso studiate nei due principali pathway cellulari di ricombinazione.


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