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Tesi etd-11252008-112048


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
CARMIGNANI, ELENA
URN
etd-11252008-112048
Title
Studio degli effetti prodotti dall'ablazione funzionale del gene Djmot sulle cellule staminali delle planarie
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Commissione
Relatore Prof.ssa Batistoni, Renata
Parole chiave
  • Cellule staminali
  • rigenerazione
  • mortalina
Data inizio appello
15/12/2008;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
15/12/2048
Riassunto analitico
Le cellule staminali presenti negli organismi adulti presiedono l’omeostasi tissutale. La loro potenzialità proliferativa può, anche se in minima parte, diminuire nel tempo per alcune modificazioni che la cellula subisce a causa di vari stress derivanti dal metabolismo cellulare o dall’ambiente circostante e che possono produrre danni al DNA. Uno degli obbiettivi principali della medicina rigenerativa è proprio quello di capire come queste cellule riescano a “difendersi” dall’invecchiamento, cioè dal processo di senescenza cellulare. Le planarie, invertebrati a simmetria bilaterale appartenenti al phylum Platelminti, sono note per la loro capacità rigenerativa e l’elevato turnover cellulare, che contribuisce alla normale omeostasi tissutale. Tali processi sono resi possibili dalla presenza di una popolazione di cellule staminali adulte pluripotenti, chiamate neoblasti, distribuite nel parenchima (tessuto mesenchimale). I neoblasti sono le uniche cellule capaci di proliferare e anche di differenziare in qualsiasi tipo cellulare e il loro potenziale rigenerativo è illimitato. Dati di letteratura dimostrano che le Heat Shock Proteins (HSPs) svolgono un ruolo fondamentale nei processi di omeostasi cellulare e vengono attivate in seguito ad eventi di stress. In un precedente lavoro condotto in laboratorio sono stati caratterizzati alcuni geni codificanti per HSPs espresse prevalentemente nei neoblasti. Fra questi il gene Djmot, che codifica per un membro della famiglia Hsp70 e che mostra un’elevata similarità con la mortalina (mortalin/mthsp70/PBP74/Grp75), attivata in tumori ed in cellule di mammifero immortalizzate. Il pattern di espressione di Djmot molto simile a quello di Djmcm2 e Djpcna e la scomparsa dell’espressione parenchimale di Djmot dopo somministrazione di una dose letale di raggi X (le uniche cellule radiosensibili sono quelle in proliferazione, cioè i neoblasti) hanno portato alla conclusione che Djmot venga espresso nei neoblasti. Inoltre studi funzionali condotti mediante la tecnica dell’RNA interference (RNAi) dimostrano che Djmot svolge un ruolo fondamentale durante la rigenerazione in quanto la sua ablazione funzionale comporta l’assenza di blastema rigenerativo o anomalie nella sua formazione. In questo lavoro di tesi ho analizzato dettagliatamente gli effetti dell’ablazione funzionale del gene Djmot sulle cellule staminali delle planarie. Per questo studio ho utilizzato alcuni marcatori di neoblasti disponibili nella planaria Dugesia japonica: Djpcna, Djmcm2, DjPiwi-1, Djnos. PCNA (antigene nucleare di proliferazione cellulare) è espresso nel nucleo di cellule in proliferazione e quindi nel nucleo dei neoblasti; l’utilizzo di un anticorpo anti-PCNA dopo ibridazione in situ con Djmot ha permesso di verificare l’espressione di questo gene in cellule PCNA positive, quindi nei neoblasti. Tuttavia, le ibridazioni in situ sulle sezioni, seguite da immunocolorazione con PCNA, rivelano presenza di segnale di ibridazione anche in altre piccole cellule negative per PCNA. Queste cellule potrebbero essere neoblasti già determinati verso un destino differenziativo. Djmcm2, un gene che codifica per un componente del complesso di pre-replicazione del DNA, permette di visualizzare la distribuzione spaziale dei neoblasti con potenzialità proliferativa. L’utilizzo di questo marcatore dopo Djmot RNAi su planarie rigeneranti rivela una drastica riduzione del livello di espressione di questo gene rispetto ai controlli, confermata anche dai dati ottenuti mediante real-time RT-PCR. Nelle planarie è stato anche recentemente clonato un omologo del gene nanos che è stato chiamato Djnos. Come anche in altri organismi Djnos è espresso nelle cellule staminali della linea germinale. Nelle forme asessuate di planaria le cellule nanos positive sono ugualmente presenti e sono distribuite in due cordoni laterali dorsali. Dopo RNAi di Djmot su planarie rigeneranti si osserva una diminuzione del segnale di ibridazione rispetto alle planarie iniettate con acqua (controlli), confermata anche dai dati ottenuti mediante real-time RT-PCR. DjPiwi-1 presenta una forte similarità con i membri della famiglia Piwi-Argonauta, che codificano proteine coinvolte con il mantenimento delle cellule staminali ed è un marcatore specifico per una sottopopolazione di neoblasti localizzati dorsalmente a livello della linea mediana. L’ablazione funzionale di Djmot ha un effetto soltanto parziale sull’espressione di DjPiwi-1. Infatti il segnale di ibridazione, sebbene ridotto, rimane evidente in planarie rigeneranti dopo RNAi Djmot ed anche gli esperimenti di real-time RT-PCR mostrano soltanto una parziale riduzione del livello dei trascritti rispetto ai controlli. La spiegazione più probabile di questi risultati è che la popolazione di cellule DjPiwi-1 positive sia una popolazione eterogenea. Esperimenti di Djmot RNAi associati a studi di espressione con marcatori di cellule differenziate (Djsyt e Djmhc-b) effettutati mediante real-time RT-PCR non mostrano significative differenze nel livello di espressione di questi due geni nelle planarie iniettate e nei controlli. Infine, per analizzare la presenza di alterazioni nel numero di mitosi, frammenti di planarie rigeneranti la testa o la coda, iniettate con RNA a doppio filamento (ds) Djmot o con acqua, sono stati messi in una soluzione contenente colchicina e sono stati dissociati in singole cellule, messe quindi su vetrino. Il nucleo è stato messo in evidenza con Hoechst 33258 e le cellule sono state contate con l’impiego di un emocitometro. Il numero di cellule in metafase è stato determinato al microscopio a fluorescenza. Il rapporto tra il numero di mitosi ed il numero di cellule totali sul vetrino fornisce un indice utile all’osservazione del cambiamento o meno del numero di mitosi. In questo modo è stato osservato che nelle planarie iniettate con dsRNA Djmot si ha una drastica riduzione della percentuale di mitosi rispetto agli animali iniettati con acqua. La diminuzione o la scomparsa di neoblasti spiega, quindi, la mancata formazione del blastema, come nel caso di planarie che rigenerano la coda, o la mancanza di blastema o la formazione di un blastema più piccolo, con anomalie morfologiche, in planarie che rigenerano la testa. Studi preliminari sul destino dei neoblasti dopo Djmot RNAi sono stati effettuati su macerati cellulari ottenuti dalle planarie iniettate con RNA (dsRNA) Djmot. Dall’analisi morfologica delle cellule è stato possibile osservare la presenza di numerose cellule appiattite ed allargate, quindi dall’aspetto senescente, mentre non si ritrovano più cellule con la morfologia tipica dei neoblasti. Uno dei marcatori correlati alla senescenza è p53. Dati di letteratura dimostrano che la mortalina presenta un sito di legame a p53: questo legame impedisce a p53 di entrare nel nucleo e promuovere apoptosi o senescenza. Dall’ analisi di sequenza è risultato che anche in Djmot è presente un ipotetico sito di legame a p53; l’ablazione funzionale di Djmot, quindi, potrebbe comportare l’attivazione di p53 con conseguente avvio del processo di senescenza. A sostegno di questa possibilità è stato osservato che un anticorpo sintetizzato contro la regione di legame a p53 della mortalina della vongola Mya arenaria (Mamot), quando utilizzato su macerati cellulari ottenuti da planarie, si localizza in piccole cellule che presentano la morfologia tipica dei neoblasti.
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