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Tesi etd-11242010-124924


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
RIPA, ROBERTO
URN
etd-11242010-124924
Title
Caratterizzazione di geni codificanti metalloproteasi ADAM e M48 nella planaria Schmidtea mediterranea
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Supervisors
relatore Prof.ssa Batistoni, Renata
Parole chiave
  • rigenerazione
  • invecchiamento
  • planaria
Data inizio appello
13/12/2010;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
13/12/2050
Riassunto analitico
Studente: Roberto Ripa Matricola: 447444
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Laurea specialistica in: Scienze e Tecnologie Biomolecolari
Relatore: Renata Batistoni
CARATTERIZZAZIONE DI GENI CODIFICANTI METALLOPROTEASI ADAM E M48
NELLA PLANARIA SCHMIDTEA MEDITERRANEA.
Rigenerare tessuti, e quindi organi, in maniera controllata è l’ambitissimo obiettivo delle medicina
rigenerativa. Il “primum movens” di questa frontiera di ricerca sono le cellule staminali, cellule
indifferenziate dotate di un elevatissimo potenziale proliferativo e differenziativo, grazie al quale
mantengono l’omeostasi tissutale. Caratterizzare queste cellule e capire i meccanismi su cui si basa il loro
funzionamento è fondamentale per poter conseguire le implicazioni cliniche. Lo studio delle cellule staminali
viene prevalentemente effettuato “in vitro”, tramite colture cellulari, ma negli ultimi anni la comunità
scientifica ha rivolto l’attenzione verso sistemi modello animali alternativi ai mammiferi che, grazie alle
straordinarie doti rigenerative, ne permettono lo studio “in vivo”. In questo contesto, uno dei più promettenti
modelli animali sono le planarie, platelminti tricladi a vita libera dotati di simmetria bilaterale. Questi
invertebrati hanno un potenziale rigenerativo straordinario: infatti è sufficiente un numero di appena 10^4
cellule per rigenerare un organismo completo. Si ritiene che questa straordinaria capacità derivi dalla
presenza di una popolazione cellulare staminale (neoblasti). I neoblasti sono distribuiti nel mesenchima ed
evidenze sperimentali indicano che sono continuamente in fase replicativa, garantendo un continuo turn-
over tissutale e potenziale rigenerativo. Tuttavia non è ancora chiaro come i neoblasti ricevono segnali
proliferativi o differenziativi e come migrano dalle loro nicchie verso il sito di taglio per garantire la
formazione del blastema rigenerativo. E’ noto che le metalloproteasi, proteine di membrana ad attività
proteolitica, giocano un ruolo fondamentale nel rimodellamento della matrice extracellulare (ECM)
favorendo fenomeni migratori o anche regolando il “signaling” di fattori di crescita, citochine e altri fattori
secreti. Obiettivo del mio lavoro di tesi è stato quello di caratterizzare, nella planaria Schmidtea
mediterranea, i geni che codificano un gruppo di metalloproteasi, appartenenti alla famiglia delle
metzincine, denominate ADAM (a disintegrine and metallopeptidase) e alla famiglia delle peptidasi M48.
Una preliminare analisi bioinformatica ha permesso di isolare otto geni ADAM-like e un gene codificante
una endopeptidasi M48. Tutti i geni analizzati presentano un’organizzazione genomica in introni ed esoni,
ad eccezione di tre ADAM-like e la endopeptidasi (Smed-kuzbanian1,Smed-kuzbanian2,Smed-kuzbanian4,
Smed-m48) che presentano un’unica ORF aperta. La sequenza amminoacidica predetta di 4 geni ADAM-like
(Smed-kuzbanian-1,2,3,4) mostra buona similarità con la proteina “kuzbanian” di Drosophila, mentre le
rimanenti ADAM-like (Smed-adam1, Smed-adam2, Smed-adam3, Smed-adam4) hanno buona similarità con
le ADAM di mammifero 12,23,9,19. L’unica endopeptidasi della famiglia M48 isolata (Smed-m48) mostra
similarità con la peptidasi di mammifero FACE1(ZmpSTE24), coinvolta con patologie correlate con
l’invecchiamento precoce. L’analisi dell’espressione genica è stata effettuata tramite real time RT-PCR ed
ibridazione in situ (WISH). Quattro dei geni analizzati non sembrano essere espressi (Smed-adam1,Smed-
adam4,Smed-kuzbabian1,Smed-kuzbanian2), tre danno un pattern di espressione diffuso nel parenchima
(Smed-kuzbanian4,Smed-kuzbanian3,Smed-adam2), infine un gene(Smed-adam3) codificante una proteina
simile ad ADAM23, mostra un’espressione specifica nel sistema nervoso. Il gene simile a zmpste24 presenta
un dominio di espressione limitato attorno al faringe e attorno ai cordoni nervosi. Tutte le proteine predette
ADAM-like presentano un dominio catalitico disintegrinico e un dominio ricco in cisteine; solo la proteina
codificata dal gene Smed-adam2 presenta anche un dominio EGF, mentre la proteina dedotta SMED-M48
possiede un peptide segnale, un dominio transmembrana e un dominio zinco-catalitico. Poiché in planaria la
funzione genica può essere dedotta dagli effetti fenotipici prodotti dall’ablazione funzionale mediata da RNA
a doppio filamento (RNA interference), ho anche iniziato la caratterizzazione funzionale dei geni studiati.
L’espressione di (Smed-adam3), limitata al solo sistema nervoso e aumentata durante le fasi tardive di
rigenerazione, sembra essere particolarmente interessante. La proteina predetta di questo gene presenta inoltre un dominio catalitico atipico, mancante di una delle tre istidine di coordinazione per lo zinco, nonchè
della “metionina di giro”. E’ possibile quindi che questo dominio non sia attivo, similamente a quanto
dimostrato in ADAM23 di mammifero. Questa proteina infatti, coinvolta in fenomeni di guida assonale nel
sistema nervoso centrale, ha un dominio zinco-catalitico non funzionante e agisce tramite il dominio
disintegrinico. Ho quindi iniziato lo studio funzionale dei geni (Smed-adam3 e Smed-m48) tramite
microiniezione di RNA specifico a doppio filamento in S. mediterranea.
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