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Tesi etd-11162012-104539


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
CERRI, IACOPO
URN
etd-11162012-104539
Title
Analisi dei geni partners di BRCA1 della ricombinazione omologa del DNA nella suscettibilita al tumore della mammella.
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Commissione
relatore Prof. Bevilacqua, Generoso
relatore Dott.ssa Caligo, Maria Adelaide
Parole chiave
  • BRCA1
  • hSSB1
  • EEF1E1
  • ricombinazione omologa
  • carcinoma alla mammella ereditario
Data inizio appello
06/12/2012;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
06/12/2052
Riassunto analitico
Il tumore alla mammella è la neoplasia più frequente nelle donne. <br>Il 20% dei casi è di origine familiare e il 40% di questi è dovuto a mutazioni patogenetiche <br>nei geni BRCA1 e BRCA2. Sebbene siano stati identificati altri geni di suscettibilità ad alta <br>penetranza, la maggior parte della suscettibilità genetica a questo tumore è attribuibile ad <br>un modello poligenico in cui varianti, sia polimorfismi che mutazioni, in un largo numero di <br>geni, anche se singolarmente associate ad un basso rischio, contribuiscono insieme alla <br>predisposizione allo sviluppo del tumore.<br>BRCA1 e BRCA2 codificano per delle proteine che sono implicate nella trascrizione <br>genica, nella stabilità genomica e nel riparo del DNA. Il mio progetto di tesi si è focalizzato <br>sul coinvolgimento del gene BRCA1 nel riparo del DNA ed in particolar modo nel processo <br>di riparo delle rotture a doppia elica del DNA (DSB) mediato dal meccanismo di <br>ricombinazione omologa.<br>In un lavoro svolto in precedenza nel laboratorio mediante tecnologia microarray (Agilent <br>44K Whole Human Genome Oligo Microarray), erano stati confrontati, i profili di <br>espressione genica di cellule HeLa trasfettate transientemente con due varianti di <br>BRCA1(M1775R, A1789T), di cui una classificata come patogenetica e l’altra di significato <br>patogenetico sconosciuto, con il profilo di espressione ottenuto dalla trasfezione di BRCA1 <br>wt. L’ipotesi era che l’overespressione, seppure transiente, di forme mutate del gene <br>BRCA1 potesse produrre un differente profilo di espressione genica nelle cellule HeLa <br>rispetto alla forma wt. Sono stati così individuati numerosi geni sovra- e sotto-espressi ed i <br>più interessanti validati in RT-PCR ed in Western Blot. Tra questi sono stati selezionati <br>quelli coinvolti nella riparazione del DNA.<br>La mia tesi si focalizza su due di questi possibili geni partner di BRCA1 (BGP): hSSB1 e <br>EEF1E1.<br>HSSB1, la cui espressione risultava aumentata nella variante A1789T, codifica per una <br>single strand DNA-binding protein che partecipa al riparo delle rotture a doppio filamento <br>di DNA e al pathway di attivazione di ATM <br>EEF1E1, la cui espressione risultava ridotta nella stessa variante A1789T, codifica per un <br>fattore associato al complesso tRNAsintetasi anche importante per il processo di <br>attivazione di TP53 mediante la via di ATM/ATR in risposta al danno al DNA .<br>In primo luogo abbiamo voluto osservare se la frequenza di ricombinazione venisse alterata silenziando l&#39;espressione di questi geni. Per fare ciò abbiamo silenziato i geni con <br>degli specifici siRNA in cellule HeLa. Le cellule utilizzate contengono un particolare <br>costrutto -hprtDRGFP che permette di valutare gli eventi di ricombinazione omologa e <br>misurarli tramite analisi di fluorescenza utilizzando il FACS o il semplice conteggio delle <br>cellule fluorescenti al microscopio. Abbiamo osservato che la frequenza di ricombinazione <br>valutata si riduceva del 27,7% in seguito al silenziamento sebbene parziale del gene <br>hSSB1 e del 41,7% per EEF1E1 rispetto ai controlli positivi (siRNA per il gene HPRT) e ai <br>controlli negativi (Screamble Negative Control Duplex).<br>Questi risultati erano indicativi del possibile coinvolgimento di questi due geni nel pathway <br>del riparo al DNA cui partecipa anche BRCA1. Per questo motivo ho voluto verificare se <br>questi due geni fossero target di mutazioni inattivanti in casi familiari di carcinoma <br>mammario negativi per le mutazioni dei geni BRCA1 e BRCA2.<br>Per svolgere questo tipo di indagine ho selezionato un gruppo di 39 probandi da famiglie <br>ad alto rischio (calcolato tramite il software BOADICEA e BRCAPRO), wild type per <br>BRCA1 e BRCA2 e affette da tumore alla mammella. L&#39;analisi è stata condotta attraverso <br>PCR e sequenziamento diretto.
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