• Fabrea salina
• proteomica
• radiazione UV
• sequenziamento de novo.

La radiazione UV interagisce profondamente con la biosfera, causando effetti significativi a tutti i livelli: dai danni alle macromolecole biologiche (es.: dimerizzazione del DNA) a effetti metabolici (creazioni di specie reattive dell’ossigeno), tissutali (tumori della pelle, cataratta, eritema) a perturbazione dell’equilibrio di ecosistemi con prevalenza delle specie maggiormente resistenti.
Per queste ragioni, lo studio dell’effetto della radiazione UV e dei relativi meccanismi molecolari di difesa è di grande importanza per la biologia e l’ecologia.
Fabrea salina è un ciliato ipersalino, noto fin dalla metà del secolo scorso per essere tra i più resistenti alla radiazione UV, e per questo preso a modello negli studi sui meccanismi molecolari di recupero/riparo/antagonismo dello stress da radiazione.
La completa assenza di dati genomici in F. salina, unita alla scarsa omologia che esiste tra genomi di ciliati ed altri organismi induce a privilegiare un approccio di tipo proteomico, per ottenere un primo screening delle perturbazioni indotte dalla radiazione UV nel profilo di espressione proteico. Questa metodica, però, in F. salina va costruita quasi ex-novo, in quanto le peculiarità chimiche del mezzo (elevata salinità) e molecolari dell’organismo (presenza di pigmenti, proteine con adattamento molecolare alofilo) rendono inefficace l’applicazione di protocolli standard.
Il presente lavoro di tesi consiste quindi in una ricerca metodologica che, prendendo in esame diverse tecnologie e protocolli porti a configurare una strategia efficace nella risoluzione del profilo di espressione proteico di F. salina e permetta quindi di investigare le perturbazioni UV-indotte.
Dal punto di vista sperimentale sono state confrontate le due maggiori tecniche proteomiche quali elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilammide (2D-PAGE) e cromatografia liquida ad alta risoluzione su colonna a gel filtrazione.
Per ciascuna tecnica sono stati discussi possibili protocolli d’uso, le relative performances ottenibili e le modifiche proposte per ottimizzarne l’applicazione alla F.salina.
Il risultato finale della presente tesi consiste nell’elaborazione di un protocollo specifico basato su 2D-PAGE gel accoppiato con un sequenziamento de novo ottenuto per tandem mass spectrometry. L’elaborato presenta i risultati sperimentali che avvalorano questa scelta.