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Il carcinoma colorettale (CCR) è il secondo tumore più frequente in Europa. La presenza di familiarità in una frazione consistente (30%) dei casi suggerisce il coinvolgimento di fattori genetici. Mutazioni ereditarie altamente penetranti associate a quadri clinici ben caratterizzati sono state identificate nel 5% dei casi di CCR. Oggi si conoscono diverse forme cliniche e diversi geni responsabili di predisposizione ereditaria allo sviluppo di CCR. Le condizioni più frequenti sono la Sindrome di Lynch (SL), associata a mutazioni a carico di geni coinvolti nel sistema del Mismatch Repair, la poliposi adenomatosa familiare (Familial Adenomatous Polyposis, FAP) associata a mutazioni dell’oncosoppressore APC, e la poliposi associata al gene MUTYH (MUTYH-Associated Polyposis (MAP), dovuta a mutazioni del gene MUTYH. A differenza delle altre forme, tutte trasmesse con modalità autosomica dominante, la MAP è un carattere autosomico recessivo, ed è dovuta a difetti del sistema di riparo dei danni ossidativi al DNA per escissione di basi (Base Excision Repair, BER). In particolare, il gene responsabile di questa forma di poliposi è MUTYH, che codifica una glicosilasi che rimuove l’adenina dall’appaiamento anomalo A:8-OxoG (7,8-diidro-8-oxo-guanina). La caratterizzazione molecolare dei tumori (polipi e carcinomi) dei soggetti con difetti costituzionali di MUTYH ha evidenziato un eccesso di trasversioni somatiche G>T nei geni coinvolti nella tumorigenesi colorettale, in particolare APC e KRAS. Attualmente il Leiden Open Variation Database riporta poco più di 100 differenti varianti di sequenza di MUTYH. Accanto a varianti di chiaro significato patogenetico, esistono varianti più rare, disperse su tutto il gene e di difficile interpretazione. Dall’analisi dei dati presenti in letteratura è emerso che circa il 30% delle varianti nucleotidiche riscontrate in MUTYH è costituito da Variant of Unknown Significance (VUS). La maggior parte delle VUS sono variazioni di sequenza di tipo missenso, che possono determinare alterazioni della struttura e/o della funzione della proteina codificata o, in alternativa, possono avere effetti a livello dell’mRNA. Possono altresì presentarsi varianti silenti o alterazioni nella sequenza nucleotidica, nelle regioni regolatrici e non codificanti dei geni (introni, 5’UTR e 3’UTR). L’identificazione delle mutazioni che alterano la funzionalità di una proteina e sono responsabili della comparsa di fenotipi patologici è di grande importanza per la diagnosi e il counseling genetico. Infatti, in presenza di una VUS non è possibile effettuare test predittivi, e ciò lascia incertezza sull’entità del rischio per i membri della famiglia. Negli ultimi anni, sono stati utilizzati molteplici approcci indipendenti al fine di chiarire il ruolo clinico e biologico delle VUS. Tali approcci, suddivisi in diretti ed indiretti, sono basati su analisi di segregazione, studi caso-controllo, predizioni in silico, analisi di splicing ed espressione genica, e saggi funzionali in vitro.
Scopo del lavoro di questa tesi è stato quello di valutare il significato e la frequenza di 7 VUS del gene MUTYH identificate nella nostra casistica di pazienti con sospetta MAP mediante l’utilizzo di approcci molecolari e bioinformatici. A tal fine sono stati effettuati: 1. studio di DNA di campioni di controllo mediante High Resolution Melting Analysis (HRMA) e sequenziamento diretto; 2. studio del tessuto tumorale dei soggetti in cui segregano le VUS mediante sequenziamento diretto al fine di identificare la presenza di Loss of Heterozigosity (LOH); 3. predizioni in silico delle potenziali conseguenze delle VUS sulla funzione dei prodotti proteici e sullo splicing, grazie all’utilizzo di programmi dedicati. In base a tale analisi è stato possibile classificare le VUS in base alle indicazioni dello IARC Working Group on Unclassified Genetic Variants (Plon et al., Hum. Mutat. 2008, 29:1282-1291). I dati ottenuti dimostrano l’importanza di un approccio multidisciplinare al fine di una corretta classificazione delle VUS.