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Tesi etd-11112010-150633


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
DI MAIO, GIUSEPPE
URN
etd-11112010-150633
Title
La somministrazione di metanfetamina produce un incremento di proteina prionica in vitro e in vivo
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
NEUROBIOLOGIA
Commissione
relatore Dott.ssa Falleni, Alessandra
relatore Dott.ssa Lenzi, Paola
Parole chiave
  • proteina prionica
  • metanfetamina
Data inizio appello
13/12/2010;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
13/12/2050
Riassunto analitico
La proteina prionica (PrPc) è una glicoproteina altamente conservata, espressa sulla superficie cellulare di tutti i<br>tessuti di mammifero, in particolare nel sistema nervoso centrale (SNC). Nel SNC è espressa fisiologicamente in<br>diverse aree cerebrali e data la sua localizzazione sulla membrana plasmatica sono state ipotizzate diverse possibili<br>funzioni: facilitazione degli impulsi nervosi mediando la trasmissione del segnale dalla matrice extracellulare<br>all’ambiente intracelluare, regolazione del ritmo circadiano, azione anti-apoptotica e possibile implicazione<br>nell’omeostasi del rame. Teorie più recenti ipotizzano che tale proteina sia anche coinvolta nella risposta cellulare<br>specifica verso particolari infezioni batteriche. L’alterazione della struttura secondaria della proteina prionica porta<br>alla forma alterata nota come “scrapie-like prion protein” (PrPsc), le due forme di proteina differiscono solo per un<br>cambio conformazionale e condividono la stessa struttura primaria e le stesse modifiche post-traduzionali. Questo<br>cambio strutturale altera significativamente le proprietà chimico-fisiche e biologiche della PrPc. La PrPsc essendo<br>poco solubile precipita formando aggregati che innescano una reazione a catena autopropagandosi in un organismo<br>ospite e danneggiando il tessuto nervoso. Il meccanismo di conversione della PrPc nella sua forma mutata è ancora<br>sconosciuto. Lo scopo della presente tesi è stato di indagare se il trattamento con metanfetamina (MA), una<br>neurotossina molto usata come sostanza d’abuso e capace di indurre stress ossidativi in diverse aree cerebrali, può<br>indurre l’accumulo di PrPc nel citoplasma e promuovere la formazione di PrPsc sia in vivo che in vitro.<br>Per gli studi in vivo sono stati utilizzati topi C57Bl di 8-9 settimane trattati con una dose neurotossica di MA (5mg/kg<br>x3 ogni 2 ore) e sacrificati a tempi diversi (24-168 ore dopo il trattamento). Gli animali anestetizzati con cloralio<br>idrato, sono stati toracotomizzati e perfusi con fissativo. Gli encefali sono stati fissati e inclusi per la microscopia<br>ottica. Per le indagini di Western blot dai cervelli prelevati sono stati dissezionati gli striati e la corteccia motoria. Gli<br>studi in vitro sono stati condotti sia su colture cellulari di PC12 e sia su colture striatali primarie. Le cellule PC12<br>sono state esposte a 1mM di MA per un tempo di 12, 24, 72, 168 ore e successivamente utilizzate per indagini di<br>immunoelettromicroscopia, immunocitochimica e Western blot. Le colture primarie di cellule striatali sono state<br>esposte a differenti dosi di dopamina (DA), 0,1-1,0 mM, per un tempo da 24 a 168 ore e successivamente utilizzate<br>per analisi di microscopia elettronica.<br>Negli esperimenti in vivo è stato osservato un incremento di espressione di PrPc e di PrPsc negli striati di animali<br>trattati con MA a 168 ore dal trattamento sia per le analisi di immunoistochimica che di immunoblotting. Gli studi in<br>vitro su cellule GABAergiche striatali dopo esposizione a DA hanno mostrato un aumento delle cellule contenenti<br>PrPc e PrPsc rispetto al controllo e in particolare tale aumento è stato osservato sia nel nucleo che nel citoplasma.<br>L’analisi di colture di PC12 ha evidenziato un risultato analogo già a 12 ore di esposizione a MA.<br>Studi recenti hanno dimostrato che una esposizione prolungata delle PC12 a MA (72 ore) produce la formazione di<br>inclusioni citoplasmatiche (vacuoli, whorl di membrana) che contengono proteine sia del sistema UP che del sistema<br>autofagico. E’ stato quindi interessante verificare l’eventuale presenza delle due forme di PrP in tali inclusioni.<br>L’osservazione al microscopio elettronico ha evidenziato che negli inclusi citoplasmatici sono presenti le due forme<br>della proteina.<br>In conclusione gli esperimenti in vivo e in vitro hanno prodotto analoghi risultati dimostrando che la<br>somministrazione di MA produce un aumento sia dei livelli di PrPc sia di PrPsc. Gli effetti neurotossici della MA<br>sono mediati dalla DA che determina uno stress ossidativo responsabile della saturazione dei sistemi di<br>detossificazione cellulare. Questo ha come conseguenza un’inibizione dei sistemi stessi e quindi un accumulo di PrPc.<br>Pertanto la modulazione di tali sistemi di detossificazione può avere un ruolo importante nell’accumulo di PrPc nel<br>citoplasma, evento che sembra responsabile della formazione di PrPsc e quindi della neurotossicità. I nostri dati in<br>accordo con studi recenti indicano che la neurotossicità dovuta alla PrP può non dipendere dall’infezione di PrPsc<br>esogena, ma può derivare da un accumulo della PrPc nel citoplasma. Tale accumulo può essere dovuto ad una<br>insufficiente attività dei sistemi di detossicazione, UP e autofagico, per la PrPc.
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