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Tesi etd-10272004-131117


Thesis type
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Author
Rossi, Mario
email address
mario.rossi903@virgilio.it
URN
etd-10272004-131117
Title
Sviluppo del sistema neuroenterico: effetto di GDNF e ET3 su una linea cellulare modello (Neuro2A).
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE
Commissione
relatore Prof. Sbrana, Isabella
relatore Dott. Puliti, Aldamaria
Parole chiave
  • Neuro2A
  • ET3
  • Sistema neuroenterico
  • Hirschsprung
  • GDNF
Data inizio appello
15/11/2004;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
15/11/2044
Riassunto analitico
Le cellule delle creste neurali (NCC) originano dalla parte dorsale del tubo neurale e vanno incontro a migrazione, proliferazione e differenziamento, processi che sono determinati dall&#39;interazione di queste cellule con i diversi fattori ambientali.<br>Il sistema nervoso enterico (ENS) prende origine dalle cellule delle creste neurali vagali e sacrali e si organizza in una complessa rete di gangli e neuroni a livello della parete dell&#39;intestino, così da controllarne la motilità. Durante il suo sviluppo, possono però insorgere diversi problemi, un esempio caratteristico è riscontrabile nella malattia di Hirschsprung (HSCR) o aganglia congenita dell&#39;intestino, dovuta all&#39;incapacità da parte delle cellule delle creste neurali (NCC) di formare gangli enterici. Questa malattia ha una frequenza di 1/5000 nati-vivi e consiste in un&#39;ostruzione intestinale potenzialmente letale che è rimossa chirurgicamente.<br>Penetranza incompleta, espressività variabile e dipendenza dal sesso sono le caratteristiche identificate nelle famiglie di pazienti HSCR, ciò suggerisce che ci sia un&#39;interazione genica e ambientale di base nella determinazione di questo fenotipo.<br>Sono stati identificati ben nove geni che correlano con la malattia: il protoncogene RET ed il suo ligando più importante, il fattore neuro-trofico che deriva dalla linea delle cellule gliali GDNF, la neurturina (NTN) un altro ligando di RET, l&#39;endotelina-3 (ET-3) ed il suo recettore B (EDNR-B), l&#39;enzima che converte l&#39;endotelina (ECE1), SOX10, SIP1 e phox2B. Inoltre si osserva che i pathways che vengono coivolti nella determinazione della malattia di HSCR sono di RET e EDNRB, infatti gli altri geni trovati associati all&#39;HSCR fanno parte di queste due vie metaboliche, ad esempio GDNF è il ligando di RET e ET3 è quello di EDNRB. Mutazioni in RET e EDNRB sono le cause più comuni dell&#39;HSCR: alterazioni in RET sono state riscontrate nel 50% dei casi familiari e nel 15-20% di quelli sporadici, mentre in meno del 5% dei pazienti sono state identificate alterazioni nel recettore B dell&#39;endotelina 3. Recenti studi hanno messo in luce il ruolo di ET3 e GDNF nello sviluppo del sistema nervoso enterico, infatti, i pathways attivati da queste molecole sono indispensabili per la corretta migrazione e differenziamento delle cellule delle creste neurali vagali e sacrali. Utilizzando estratti di cellule dell&#39;intestino di embrioni di 10/11 giorni è stato osservato che GDNF stimola la proliferazione cellulare e ha inoltre un potere chemiotattico per queste cellule, mentre ET3 è in grado di inibire il differenziamento neuronale e di ridurre l&#39;azione chemioattrattiva di GDNF. Per approfondire l&#39;analisi sugli effetti biologici di Gdnf ed Et3 abbiamo allestito colture cellulari di una linea di neuroblastoma di topo (Neuro 2A) utilizzata come modello cellulare rappresentativo delle cellule delle creste neurali. L&#39;espressione di RET, EDNRB e GFRA1 è stata verificata nelle cellule neuro2A mediante RT-PCR in esperimenti preliminari, inoltre è stata evidenziata la presenza a livello proteico di RET mediante esperimenti d&#39;immunocitochimica. L&#39;espressione dei tre recettori nelle mouse neuro2A, ha confermato l&#39;idoneità di questa linea cellulare a rappresentare le NCC. Forti di questo dato le mouse neuro2A sono state utilizzate per ottenere i primi dati sperimentali sugli effetti di GDNF ed ET3. Combinazioni di GDNF, ET3 e dei loro rispettivi inibitori, caratterizzano gli esperimenti su questa linea cellulare. Dopo un certo periodo di trattamento che è variato da 3 a 4 giorni, le cellule sono state fissate ed analizzate allo scopo di valutare, proliferazione e differenziamento. In particolare, per la valutazione della proliferazione cellulare si è proceduto con il conteggio delle cellule ed è stato messo a punto il protocollo per la rivelazione delle cellule positive all&#39;incorporazione del BrdU. Per valutare gli effetti dei trattamenti sul differenziamento, le cellule sono state suddivise in 5 classi morfologiche e contate per campi casuali utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Si è quindi valutato l&#39;effetto dei trattamenti sul numero di cellule differenziate valutandone le percentuali sul totale delle cellule lette. Inoltre è stato valutato l&#39;effetto dei trattamenti sulla distribuizione in classi fenotipiche calcolando la percentuale di una classe sul totale delle cellule differenziate.<br>I risultati ottenuti ad alte densità cellulari indicano la tendenza di GDNF a stimolare la proliferazione cellulare e la tendenza di ET3 ad inibirla, provocando anche un&#39;inibizione dell&#39;effetto di GDNF nei pozzetti in cui c&#39;erano entrambi.<br>Il differenziamento è stato valutato in esperimenti ad alta e a bassa densità cellulare ed è stato visto che per quelli ad alta densità una sottopopolazione delle Neuro2A sembra essere già ¡°committed¡± al differenziamento. Il numero di cellule differenziate cioè rimane costante dopo i vari trattamenti, mentre varia fortemente la risposta proliferativa delle cellule indifferenziate. Negli esperimenti con una bassa densità cellulare è osservabile invece, la tendeza di GDNF a far aumentare la percentuale delle cellule differenziate sul totale delle cellule lette che raggiunge la significatività statistica quando unito ad ET3. In conclusione l&#39;effetto di GDNF sulla proliferazione cellulare è osservabile ad alte densità cellulari, mentre l&#39;effetto sul differenziamento è visibile a basse densità. Comunque è stata osservata, anche negli esperimenti ad alta densità cellulare, la tendenza all&#39;aumento del fenotipo più ramificato ad indicare un effetto di GDNF sull&#39;allungamento/arborizzazione neuritica. Per quanto concerne l&#39;effetto ET3 i risultati non sono ben chiari, ma è comunque riscontrabile la tendenza ad un&#39;inibizione della proliferazione ed ad un aumento del differenziamento cellulare.<br>Gli esperimenti fatti sulle neuro2A costituiscono un&#39;ulteriore prova dell&#39;importanza della corretta attivazione di RET sia per quanto concerne la proliferazione che il differenziamento cellulare.<br>La mancata attivazione di RET oppure alterazioni che determinano cambiamenti in questa via metabolica, possono portare ad una diminuzione dalla proliferazione cellulare e ad una diminuzione del numero di cellule a fenotipo neuronale.<br>Una teoria del perché le cellule delle creste neurali non riescono ad arrivare fino all&#39;intestino distale risiede proprio nella riduzione della capacità proliferativa dei precursori enterici delle creste neurali che non proliferando in maniera adeguata, non riescono a generare un numero sufficiente di cellule in grado di innervare l&#39;intero intestino. <br>
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