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Tesi etd-10122011-185714


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
BRUZZI, RAMONA
URN
etd-10122011-185714
Title
Valutazione degli effetti modulatori di Cetuximab e Temsirolimus sulla linea tumorale COLO320 e sulla sua interazione con i processi generativi e maturativi delle Cellule Dendritiche umane.
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Prof.ssa Consolini, Rita
relatore Dott.ssa Legitimo, Annalisa
correlatore Prof.ssa Nieri, Paola
Parole chiave
  • Cellule Dendritiche
  • Temsirolimus
  • effetti modulatori
  • Cetuximab
  • COLO320
Data inizio appello
16/11/2011;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Il microambiente tumorale è un tessuto dinamico ed eterogeneo ove la cellula neoplastica è in continua e reciproca interazione con lo stroma e le componenti cellulari della risposta infiammatoria.<br>I normali meccanismi di difesa dell’organismo possono giocare un ruolo chiave nell’attivare o contrastare i processi di carcinogenesi e sviluppo del tumore.<br>Diversi sono i meccanismi attraverso i quali il tumore può bloccare l’attività immunitaria antineoplastica. È stato dimostrato che esiste una immunosoppressione locale esercitata dal tumore che coinvolge, in primo luogo, le cellule dendritiche (DC). <br>Le DC sono le più potenti cellule professionali presentanti l’antigene (APC) deputate all’immunosorveglianza, in grado sia di indurre e modulare l’immunità cellulo-mediata contro patogeni, antigeni tumorali e proteine non-self, sia di mantenere la tolleranza immunologica.<br>Studi recenti hanno dimostrato che le cellule tumorali possono sfuggire al controllo immunitario mediante diversi meccanismi: inibizione del differenziamento in DC da precursori ematopoietici e monocitari CD14+, inefficiente maturazione delle DC e induzione dell’apoptosi nelle DC circolanti.<br>È stato ipotizzato che tale azione inibitoria sulle DC infiltranti il tumore sia riconducibile al rilascio di fattori come IL-6, IL-8, IL-10, VEGF e TGF-β da parte delle cellule tumorali stesse.<br>Obiettivo di questo studio è cercare di contribuire alla comprensione dei meccanismi che sottendono la soppressione immune indotta dal tumore e pertanto al disegno di future terapie immunomodulanti.<br>Per questo motivo, abbiamo investigato in vitro gli effetti di un microambiente tumorale, in particolare quello colon-rettale, sulla differenziazione dei monociti in DC e sulla maturazione di queste ultime. A tale scopo è stato utilizzato un sistema di camere Transwell che consente di esaminare gli effetti dei fattori solubili rilasciati dalle cellule neoplastiche sulle DC.<br>Come modello tumorale è stata scelta la linea umana COLO320, che risulta wild-type per la proteina KRAS.<br>Aggiuntivamente è stato valutato l’effetto dei farmaci chemioterapici Cetuximab e Temsirolimus sulla linea tumorale e sull’interazione di questa con i processi generativi e maturativi delle cellule dendritiche.<br>Il Cetuximab è un anticorpo monoclonale chimerico IgG1 prodotto in una linea cellulare di mammifero mediante tecniche di DNA ricombinante, specificamente diretto contro il recettore per il fattore di crescita epidermico (EGFR). È indicato per il trattamento di pazienti affetti da carcinoma metastatico del colon-retto con espressione di EGFR e con gene KRAS non mutato (wild-type).<br>Il Temsirolimus, un inibitore selettivo dell’mTOR (proteina a valle nella cascata del segnale generata dall’attivazione dell’EGFR), è un estere solubile in acqua analogo della rapamicina (antibiotico naturale della classe dei macrolidi con attività antifungine, antitumorali e immunosoppressive). È indicato nel trattamento di prima linea di pazienti con carcinoma avanzato a cellule renali (RCC) e nel trattamento di pazienti adulti con linfoma a cellule mantellari refrattario e/o recidivante (MCL).<br>Per verificare la presenza di un possibile effetto modulatorio, sono stati eseguiti test di citotossicità (MTT assay) dei farmaci sulla linea tumorale e sono state dosate, con metodo immunoenzimatico, le citochine (IL-6, IL-8, IL-10, TGF-β, VEGF) rilasciate nei surnatanti delle colture.<br>In base ai risultati ottenuti sono state scelte le concentrazioni dei farmaci che meglio modulavano il rilascio di citochine senza indurre un’eccessiva mortalità cellulare; queste concentrazioni sono state poi utilizzate in associazione per il trattamento delle cellule tumorali.<br>Le DC sono state generate a partire da monociti CD14+ circolanti, ottenuti da cellule mononucleate provenienti da buffy-coat di donatori sani mediante separazione immunomagnetica. I monociti CD14+ così ottenuti sono stati coltivati in presenza di fattori di crescita (GM-CSF e IL-4). Al 6° giorno di coltura le cellule ottenute (DC immature) sono state indotte a maturare mediante aggiunta di LPS per ulteriori 48 ore; all’8° giorno le cellule mature sono state sottoposte ad analisi morfologica (tramite allestimento di citocentrifugati e colorazione May-Grunwald Giemsa) e fenotipica (mediante citometria a flusso). Marcatori utilizzati sono l’antigene CD14, espresso dai monociti e perso durante il processo di generazione delle DC, le molecole costimolatorie CD40 e CD80, l’antigene HLA di classe II (HLA-DR) e l’antigene CD83 espresso dalle DC mature.<br>L’attività funzionale delle DC è stata investigata in citometria a flusso mediante valutazione dell’attività endocitotica e della capacità di presentare l’antigene ai linfociti T (reazione leucocitaria mista).<br>I nostri esperimenti hanno mostrato che la linea tumorale può parzialmente inibire la differenziazione delle DC dai precursori monocitari e ridurne la maturazione, come mostrato dalla significativa down-regolazione delle molecole costimolatorie (CD40 e CD80) e degli antigeni CD83 e HLADR, rispetto alle DC controllo. Le COLO320 sono anche in grado di inibire la funzionalità dendritica: diminuisce infatti, rispetto al controllo, sia la capacità fagocitica delle DC sia la capacità di attivare i linfociti T allogenici nella reazione leucocitaria mista.<br>Il trattamento della linea tumorale con l’associazione farmacologica ne ha ridotto l’effetto inibitorio esercitato sulla differenziazione delle DC.<br>Relativamente ai processi maturativi, il trattamento farmacologico della linea ha permesso alle DC di esprimere l’antigene CD83 (marker di maturazione) in percentuali sovrapponibili al controllo, sebbene abbia indotto una down-regolazione delle molecole costimolatorie (CD40 e CD80) e dell’antigene HLA-DR. Inoltre ha migliorato significativamente l’attività fagocitica delle DC e la loro capacità di presentare l’antigene ai linfociti T.<br>In conclusione, questi risultati preliminari sembrano dimostrare un’attività immunomodulatoria del Cetuximab e del Temsirolimus sulla linea COLO320 e sull’interazione di questa con le cellule dendritiche umane, in un modello sperimentale che si propone di ricreare in vitro un tipo di interazione cellulare presente in un microambiente tumorale. Tale attività immunomodulatoria dovrà essere confermata da ulteriori studi.<br>
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