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Tesi etd-10092012-171802


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
STEFANELLI, FABIO
email address
fabio.stefanelli@for.unipi.it
URN
etd-10092012-171802
Title
Nuovi approcci terapeutici alle malattie respiratorie croniche: modelli sperimentali in vitro
Settore scientifico disciplinare
BIO/14
Corso di studi
FISIOPATOLOGIA MEDICA E FARMACOLOGIA
Commissione
commissario Di Munno, Ombretta
commissario Blandizzi, Corrado
commissario Donadio, Carlo
tutor Prof.ssa Breschi, Maria Cristina
Parole chiave
  • rosiglitazone
  • montelukast
  • microparticelle
  • BPCO
  • asma
  • salbutamolo
Data inizio appello
22/10/2012;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Le malattie respiratorie croniche sono tra le principali cause di morbilità e mortalità e si prevede un trend in crescita per i prossimi anni. I dati forniti dall’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) stimano che, attualmente, centinaia di milioni di persone soffrono di malattie respiratorie croniche, soprattutto asma bronchiale e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). <br>Il miglioramento del quadro clinico è legato alla scoperta di nuove strategie farmacologiche; a questo riguardo, la conoscenza dei meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella patogenesi dei processi infiammatori cronici delle vie aeree, rappresenta una delle aree di ricerca più promettenti.<br>Infatti, questo studio ha avuto come obiettivo lo sviluppo di un nuovo trattamento farmacologico delle malattie croniche ostruttive. Questa esigenza nasce dal fatto che, ad oggi, la terapia maggiormente utilizzata nella gestione delle malattie croniche ostruttive, risulta essere quella che prevede l’associazione di agenti β2-adrenergici con corticosteroidi. Come accennato precedentemente, questa combinazione, oltre che a non essere efficacie su tutti i soggetti affetti da questa patologia, manifesta gravi effetti collaterali che ne limita fortemente l’utilizzo in pazienti con altre patologie e soprattutto in età pediatrica. <br>La sperimentazione ha toccato 2 diversi aspetti della patologia; il primo ha preso in esame 2 fenomeni causati dall’esacerbazione della patologia, ovvero la desensibilizzazione del recettore β2-adrenergico e l’iperplasia della muscolatura liscia, mentre il secondo era incentrato sullo studio di nuovi meccanismi patogenetici coinvolti nell’infiammazione delle cellule BSMC indotta da mitogeni.<br>I PPAR (recettori attivati dai proliferatori perossisomiali) sono fattori di trascrizione appartenenti alla superfamiglia dei recettori nucleari, i quali svolgono un ruolo fondamentale nella fisiopatologia delle malattie polmonari. <br>Nella prima fase sperimentale il target è stato quello di investigare sulle potenziali interazioni tra ligandi PPAR e il β2-agonista, salbutamolo, nella responsività e nella proliferazione delle cellule derivanti dalla muscolatura liscia bronchiale umana, per riuscire a delineare un nuovo approccio sperimentale nella terapia della patologia asmatica. <br>I dati ottenuti in questo lavoro di ricerca hanno evidenziato la presenza di un’interazione farmacologica favorevole tra agonisti PPAR-γ e salbutamolo. In particolare, gli agonisti PPAR hanno dimostrato di ripristinare, almeno in parte, la responsività al salbutamolo in cellule muscolari lisce bronchiali umane desensibilizzate con lo stesso β2-agonista. Tale effetto non è correlato ad una modulazione trascrizionale del β2-AR, che peraltro, sembra essere un processo di scarsa rilevanza nella desensibilizzazione omologa dello stesso recettore, indotta dalla prolungata esposizione in vitro al farmaco. I PPAR-γ agonisti interagiscono con il salbutamolo anche sulla proliferazione delle cellule muscolari lisce mediante un meccanismo recettore-mediato, realizzando un sinergismo di potenziamento dell’effetto antiproliferativo in assenza di citotossicità. Nonostante siano necessari ulteriori approfondimenti per chiarire meglio il meccanismo dell’interazione farmacodinamica, questi risultati sono di particolare interesse anche dal punto di vista farmacologico-clinico. Infatti, insieme alle riconosciute proprietà antiinfiammatorie, la protezione dalla desensibilizzazione omologa dei β2-agonisti ed il potenziamento reciproco dell’effetto antiproliferativo sulla muscolatura liscia delle vie respiratorie dimostrate dai nostri esperimenti, sono due aspetti che contribuiscono a qualificare i PPAR-γ agonisti come potenziali nuovi farmaci antiasmatici, particolarmente adatti all’associazione con i β2-agonisti. Per questo ultimo aspetto e per la loro contenuta tossicità, questi farmaci potrebbero rappresentare una valida alternativa all’impiego dei cortisonici, nel trattamento della patologie respiratorie croniche.<br>Le microparticelle (MP) costituiscono una popolazione eterogenea di vescicole rivestite di membrana citoplasmatica che possono essere rilasciate nel sangue e negli altri fluidi biologici, durante l’attivazione cellulare o l’apoptosi. I livelli di MP aumentano considerevolmente nelle vie respiratorie di soggetti asmatici e in quelle di pazienti con BPCO. Dopo essere state a lungo considerate sottoprodotti cellulari inerti, oggi, alle MP viene attribuito un ruolo in molteplici processi fisiopatologici, quali la coagulazione del sangue e l’infiammazione. <br>Sulla base di tali evidenze, abbiamo valutato il potenziale effetto pro-infiammatorio di MP derivanti da monociti/macrofagi in cellule muscolari lisce bronchiali umane (bronchial smooth muscle cells, BSMC) studiando:<br>• il release di IL-8, un’importante citochina coinvolta nella chemiotassi di neutrofili ed eosinofili nelle vie respiratorie di soggetti asmatici;<br>• l’espressione dell’enzima COX-2, che riveste un ruolo-chiave nel processo infiammatorio;<br>• la desensitizzazione eterologa del recettore β2-AR, un processo che si manifesta durante lo sviluppo delle malattie respiratorie croniche.<br><br>Le MP sono state ottenute partendo dall’isolamento dei monociti-macrofagi dal sangue periferico di volontari sani mediante gradiente di Ficoll, i quali venivano successivamente stimolati mediante un calcio ionoforo. Dai nostri esperimenti è emerso che le MP sono in grado di aumentare il rilascio di IL-8 di circa 3 volte rispetto al controllo e di modulare negativamente la funzionalità del recettore β2.<br>Infine, esperimenti di RT-PCR hanno ulteriormente confermato il ruolo pro-infiammatorio delle MP, evidenziando la loro capacità di indurre la trascrizione dell’enzima COX-2. Inoltre, è stata riscontrata una notevole induzione della produzione di PGE2 da parte delle cellule esposte alle MP, la quale potrebbe essere la causa della desensitizzazione eterologa del recettore β2 adrenergico. In accordo con tale ipotesi, abbiamo dimostrato che il trattamento con l’inibitore non selettivo indometacina e con l’inibitore COX-2 selettivo NS 398, era in grado di ripristinare la risposta al β2 agonista, in cellule desensibilizzate con MP. <br>Sono stati successivamente valutati gli effetti del Montelukast sul fenotipo pro-infiammatorio indotto dall’esposizione delle BSMC alle MP. I risultati degli esperimenti indicavano che il montelukast era capace di inibire significativamente il rilascio di IL-8 indotto dalle MP, mentre il farmaco non esercitava alcun effetto sul rilascio basale della citochina. Il montelukast ripristinava la risposta al salbutamolo, a livelli paragonabili a quelli dei controlli, in cellule desensibilizzate con MP senza alterare i livelli basali di cAMP. <br>Esperimenti effettuati medianti l’utilizzo di un inibitore dell’NF-kB hanno permesso di stabilire che l’azione proinfiammatoria delle MP deriva dall’attivazione di questa proteina e che il MTK agisce su tale bersaglio inibendo della traslocazione a livello nucleare del fattore di trascrizione.<br>Nonostante siano necessari ulteriori approfondimenti, questi risultati sono di particolare interesse dal punto di vista farmacologico-clinico. Infatti, per quanto riguarda i PPAR-γ agonisti, insieme alle riconosciute proprietà antiinfiammatorie, la protezione dalla desensitizzazione omologa dei β2-agonisti ed il potenziamento reciproco dell’effetto antiproliferativo sulla muscolatura liscia delle vie respiratorie dimostrate dai nostri esperimenti, sono due aspetti che contribuiscono a qualificare queste sostanze come potenziali nuovi farmaci per la terapia delle malattie respiratorie croniche, particolarmente adatti all’associazione con i β2-agonisti. Per questo ultimo aspetto e per la loro contenuta tossicità, questi farmaci potrebbero rappresentare una valida alternativa all’impiego dei cortisonici, nel trattamento della patologia asmatica e della BPCO.<br>Invece, i dati riguardanti lo studio degli effetti delle microparticelle, suggeriscono che potrebbero rappresentare un importante fattore coinvolto nella patogenesi delle malattie respiratorie croniche. Inoltre, i risultati degli esperimenti con il montelukast, hanno evidenziato la capacità di questo farmaco di inibire l’azione delle MP e di interagire positivamente con i β2-agonisti, mantenendone l’attività farmacologica in cellule desensibilizzate. Tali risultati confermano la validità della combinazione clinica del montelukast con i farmaci β2-agonisti, anche nei confronti di questo potenziale nuovo fattore pro-infiammatorio.<br><br>
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