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Tesi etd-09282017-113746


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
CARPITELLI, SILVIA
URN
etd-09282017-113746
Title
Ruolo del regolatore cromatinico SETD5 nello sviluppo del sistema nervoso di zebrafish: effetti della perdita di funzione in modelli stabili e transienti
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA APPLICATA ALLA BIOMEDICINA
Commissione
relatore Prof. Andreazzoli, Massimiliano
Parole chiave
  • morpholino
  • modulatori cromatinici
  • metiltransferasi
  • CRISP-Cas9
  • autism
  • ASD
  • setd5
  • zebrafish
Data inizio appello
23/10/2017;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
23/10/2020
Riassunto analitico
I disordini dello spettro autistico (ASD, Autism Spectrum Disorders) sono dei disturbi dello sviluppo neurologico con eziologia multifattoriale, ma molti studi effettuati su famiglie e gemelli hanno confermato l’importanza della componente genetica nell’insorgenza degli ASD. In pazienti affetti da tale sindrome sono state identificate per il gene SETD5 diverse mutazioni di perdita di funzione (Loss of function. Questo appartiene alla superfamiglia di proteine SET le quali sono caratterizzate da attività metiltransferasica sui residui istonici di lisinae potrebbe avere il ruolo di regolatore cromatinico nell’espressione genica.<br>Lo scopo della tesi è quello di studiare l’impatto della perdita di funzione del gene utilizzando il pesce teleosteo zebrafish (Danio Rerio) ponendo attenzione allo sviluppo del sistema nervoso centrale.<br>Abbiamo quantificato i livelli di espressione di tre trascritti di setd5 a vari stadi di sviluppo identificandone due di origine materna, mentre la terza isoforma è presente esclusivamente dopo attivazione della trascrizione zigotica. Tramite l’ibridazione in situ “whole mount” abbiamo valutato la localizzazione del trascritto di sted5 che risulta diffuso fin dalle prime ore di sviluppo in tutto il polo animale mentre agli stadi più tardivi si evidenzia una distribuzione a gradiente antero-posteriore del trascritto di setd5, che copre l’area del sistema nervoso centrale (SNC) in sviluppo, suggerendone quindi un ruolo in questo processo. In questo lavoro di tesi abbiamo continuato l’analisi, precedentemente svolta, sul fenotipo degli embrioni iniettati con morpholino oligonucleotide antisenso complementare all’mRNA nel sito di inizio della traduzione, che impedisce la sintesi della proteina, quantificando l’entità della microcefalia già riscontrata. Ottenendo una stima della diminuzione del volume cerebrale degli embrioni morfanti per setd5 agli stadi 24hpf e 48hpf(ore dopo la fecondazione) su criosezioni di embrioni fissati e colorati con Hoechst, sulle sezione è stata valutata anche la morte cellulare, prima tramite saggio acridine orange poi TUNEL+. I rusltati mostrano che a 24 hpf vi è un aumento significativo di apoptosi nei morfanti per setd5 rispetto ai controlli. E&#39; stata indagata tramite immunoisstochimica la proliferazione cellulare da cui si e rilevato un maggiore indice mitotico nei morfanti per setd5 a 48 hpf rispetto agli embrioni di controllo.<br>Inoltre abbiamo proseguito con la caratterizzazione genotipica dei pesci mutanti per il gene setd5, precedentemente ottenuti nel nostro laboratorio grazie alla tecnica CRISPR-Cas9, riscontrando delezioni che portano ad una mutazione frameshift e alla perdita di funzione del gene setd5. Inoltre stiamo procedendo con la caratterizzazione dei fenotipi dei mutanti eterozigoti adulti F1 e delle larve F2 omozigoti ed eterozigoti per la mutazione per il gene setd5.
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