• analisi di espressione
• endopoligalatturonasi
• trichoderma
• virens

La crescita della popolazione mondiale ha richiesto una produzione agricola sempre maggiore, che d’altro canto sta facendo sorgere preoccupazione per la sua sostenibilità. L’utilizzo massiccio dei fitofarmaci, inoltre, pone il problema dell’inquinamento degli ecosistemi. Detto ciò, risulta comprensibile come la ricerca di metodi alternativi alla lotta chimica ai patogeni delle piante, mediante l’impiego di microrganismi, abbia avuto negli ultimi anni un notevole impulso. Gli agenti di biocontrollo sono vantaggiosi in quanto totalmente privi di rischi per la salute umana e ad impatto ambientale trascurabile. Trichoderma riveste un ruolo importante nel controllo biologico delle colture grazie alle sue caratteristiche fisiologiche ed ecologiche. Oltre che efficace antagonista di numerosi patogeni vegetali, in recenti studi Trichoderma si è rivelato in grado di promuovere la crescita e indurre resistenza localizzata e sistemica (ISR), instaurando un’associazione di tipo simbiotico, opportunistico ed avirulento, con la pianta colonizzandone le radici. Per questo il fungo deve penetrare all’interno delle cellule vegetali. Il primo ostacolo alla penetrazione cellulare è costituito dai primi strati della parete ricchi in pectina; perciò gli enzimi pectinolitici sono tra i primi ad essere prodotti tra quelli che degradano la parete cellulare (CWDE: Cell Wall Degrading Enzymes). Le endopoligalatturonasi (endoPG), i più efficaci tra gli enzimi peptici, possono avere un ruolo pre-elicitante per lo sviluppo della resistenza, mediante la liberazione di oligogalatturonidi (elicitori) dai costituenti della parete vegetale. Sulla base di queste premesse e dei risultati ottenuti in lavori pregressi, lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di identificare geni in Trichoderma virens che codificano per endopoligalatturonasi e studiarne l’espressione.
Mediante strumenti bioinformatici sono stati identificati nel genoma di T. virens due geni endoPG, sui quali sono stati disegnati appositi primer per l’analisi di espressione.
I sistemi induttivi per l’espressione dei due geni endoPG nel micelio sono stati messi a punto sia in coltura liquida, utilizzando vari substrati (glucosio, pectina e pareti cellulari vegetali), sia su radici di piante di pomodoro in vivo ed in vitro. I risultati di RT-PCR indicano un diverso pattern di espressione per i due geni: in un caso costitutivo, nell’altro inducibile in risposta a pareti cellulari ed a pectina.
Inoltre, nelle stesse condizioni sperimentali messe a punto per la prova di espressione, è stata effettuata un’analisi istologica con il ceppo di T. virens, trasformato con il gene GFP (proteina verde fluorescente), per monitorare mediante fluorescenza la colonizzazione del fungo sulle radici. Infine è stata effettuata una valutazione semi-quantitativa e post-traduzionale dell’espressione delle poligalatturonasi, mediante il saggio Cup-Plate, nei filtrati colturali ottenuti da prove di coltura liquida dei sistemi induttivi.