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Tesi etd-09212015-175632


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
CARZOLI, LUDOVICA
URN
etd-09212015-175632
Title
Sviluppo di peptidi marcati con Fluoro-18 per una potenziale applicazione nella diagnosi dell'Amiloidosi cardiaca mediante Tomografia ad emissione di positroni
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Prof.ssa Manera, Clementina
relatore Dott. Salvadori, Piero A.
relatore Dott.ssa De Simone, Mariarosaria
Parole chiave
  • Aprotinin
  • Amyloidosis
  • Solid Phase Peptide Synthesis
  • Click Chemistry
  • Microfluidics
  • Radiolabeling
Data inizio appello
07/10/2015;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
07/10/2018
Riassunto analitico
Le amiloidosi sono un insieme eterogeneo di malattie, localizzate o sistemiche, acquisite o ereditarie, caratterizzate dall’accumulo di depositi proteici, chiamati amiloidi, nei tessuti dell’organismo. Le manifestazioni cliniche di questa patologia variano a seconda dell’organo colpito e del precursore proteico implicato nella formazione degli amiloidi.<br>Il coinvolgimento cardiaco si riscontra nelle tre maggiori tipologie di amiloidosi sistemiche: amiloidosi da catene leggere monoclonali (AL), amiloidosi ereditaria da transtiretina (ATTR) e l’amiloidosi senile (SSA). Questa complicanza ha un impatto molto sfavorevole nella prognosi, portando alla morte la maggior parte dei pazienti nel giro di pochi mesi dalla diagnosi.<br>La valutazione clinica dell’Amiloidosi cardiaca (AC) risulta difficile perché i sintomi sono comuni ad altre forme di cardiopatia e si palesano solo nelle fasi più avanzate della malattia. Nel tentativo di rendere la diagnosi sempre più precoce e accurata sono state prese in considerazione molte metodiche diagnostiche strumentali. Tra queste, le metodiche diagnostiche medico- nucleare (PET, SPECT) forniscono uno strumento con notevoli potenzialità per superare i limiti diagnostici attuali e possibilmente identificare e quantificare precocemente i depositi amiloidi. Questo è possibile grazie all’utilizzo di molecole radiomarcate, che forniscono segnali rilevabili al di là della barriera fisica costituita dal corpo umano e consentono di individuare l’infiltrazione miocardica in maniera non invasiva e potenzialmente prima della comparsa di evidenze cliniche.<br>Negli anni molti sforzi sono stati rivolti alla ricerca di marcatori molecolari in grado di rilevare con alta sensibilità e specificità i depositi amiloidi cardiaci, ma, ad oggi, ancora nessun tracciante è stato approvato per l’indagine di AC.<br>Tra le molecole che hanno mostrato un elevata affinità per gli amiloidi cardiaci, spicca l’Aprotinina, marcata con 99mTc per SPECT imaging. Si tratta di una proteina ad attività anti serin-proteasica, le cui proprietà chimiche e strutturali la rendono un ligando selettivo per le fibrille, sia nelle amiloidosi AL che ATTR.<br>Lo scopo della tesi è quello di sviluppare un piccolo peptide (25-mer), costruito sulla base della struttura dell’Aprotinina, opportunamente funzionalizzato in modo da renderlo marcabile con fluoro-18, per valutarne in prospettiva l&#39;impiego nella diagnosi dell’Amiloidosi cardiaca mediamte tomografia ad emissione di positroni (PET). <br>Questa tecnica di imaging consente di ottenere informazioni quantitative dello stato di malattia ed immagini e con una miglior risoluzione spaziale rispetto alla SPECT, soprattutto grazie alle caratteristiche fisiche del radionuclide 18F, che si vuole impiegare. <br>L&#39;attività sperimentale condotta nel lavoro di tesi parte quindi dalla progettazione e de-novo sintesi di una prima sequenza amminoacidica, basata sul frammento ciclico dell’Aprotinina 30-51aa, legato ad una Lisina-azide, tramite una sequenza di tre Glicine. In seguito è stata progettata e sintetizzata una seconda sequenza, simile alla prima, in cui è stata leggermente modificata la sequenza in vista di una migliore stabilità e gestibilità in fase di ciclizzazione.<br>La sintesi peptidica è stata effettuata in fase solida, utilizzando la chimica Fmoc e amminoacidi opportunamente protetti. La prima sequenza è stata sintetizzata usando un approccio manuale, la seconda avvalendosi di un sintetizzatore automatico a microonde. <br>La funzionalizzazione dei peptidi con un&#39;azide ha permesso l&#39;adozione di una strategia di marcatura altamente selettiva attraverso la reazione di cicloaddizione 1,3-dipolare (click-chemistry) catalizzata da rame(I) con un sintone 5-[18F]-fluoro-1-pentino, preparato allo scopo. Il triazolo formatosi nella reazione di click è ottenibile con alte rese ed in tempi brevi, perfettamente adeguati alla breve emivita del fluoro-18 (109 min). Inoltre questa reazione gode di elevato grado di biortogonalità, risultando molto stabile in vivo.<br>La sintesi del 5-[18F]-fluoro-1-pentino è stata messa a punto impiegando una piattaforma di sintesi microfluidica, mediante sostituzione nucleofila del corrispondente tosilato.<br>Tutti i passaggi sintetici sono stati controllati (resa e purezza chimica/radiochimica) mediante analisi HPLC, TLC e MS. L&#39;attività specifica del prodotto finale è stata valutata mediante HPLC impiegando il prodotto freddo (19F) preparato seguendo la stessa procedura.<br>
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