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Tesi etd-09152010-164018


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
CELLAI, FILIPPO
URN
etd-09152010-164018
Title
Presenza e modulazione di alcune isoforme di citocromo P450 in vari organi di suino sottoposti a dieta iperlipidica
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE FISIOPATOLOGICHE GENERALI
Commissione
relatore Dott. Longo, Vincenzo
Parole chiave
  • citocromo P450
  • dieta iperlipidica
  • suino
Data inizio appello
25/10/2010;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
25/10/2050
Riassunto analitico
Il sistema citocromo P450 (CYP) è una superfamiglia di enzimi che svolgono un ruolo<br>fisiologico importante nel metabolismo di sostanze endogene ed esogene. Si tratta di enzimi di fase I presenti prevalentemente a livello epatico che si riscontrano, tuttavia, anche in molti tessuti extraepatici. L&#39;espressione e l&#39;attività di alcune isoforme di CYP possono essere indotte, o inibite, da molti xenobiotici, come ad esempio farmaci o inquinanti ambientali. Anche i fattori dietetici, tra cui i lipidi, rivestono un ruolo importante nella modulazione di alcune isoforme di CYP. Le sottofamiglie 4A, 2E e 2C sono le sottofamiglie più strettamente associate al metabolismo degli<br>acidi grassi e alla modulazione da dieta iperlipidica. In questo lavoro di tesi è stato scelto il suino come modello sperimentale in quanto è stato proposto, negli ultimi anni, come modello animale per studi di farmacologia e tossicologia a causa delle sue somiglianze anatomiche e fisiologiche con l’uomo, oltre che per il suo vasto impiego in studi di patologia sperimentale per importanti malattie umane come aterosclerosi ed altre malattie cardiovascolari. Tuttavia, le conoscenze riguardo gli enzimi metabolici del suino sono scarse.<br>É noto, da studi precedenti, che una dieta iperlipidica è in grado di indurre nell’uomo e nei<br>roditori i CYP4A, tramite attivazione del recettore nucleare peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα), e il CYP2E1, e di inibire i CYP2C. Lo scopo principale di questa tesi è stato quello di investigare gli effetti di una dieta iperlipidica sulla modulazione dei CYP4A, CYP2E1 ed alcuni membri della sottofamiglia 2C (CYP2C33, 2C42, 2C49) in fegato, rene e duodeno di suino. Inoltre, è stato valutato l’effetto della dieta iperlipidica sull’espressione di geni coinvolti nel metabolismo del colesterolo, ed in particolare dei CYP7A1 e CYP27A1. Basandosi sulle sequenze geniche, parziali e complete, dei CYP di suino note in banca dati, sono stati disegnati primer specifici per varie isoforme di CYP (CYP4A21 e CYP4A24, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C42, CYP2C49, CYP7A1 e CYP27A1) e per alcuni recettori nucleari (CAR, PXR, PPARα e LXRα). È stato estratto e retrotrascritto l&#39;RNA totale proveniente da diversi tessuti prelevati da cinque suini di controllo e cinque suini alimentati con dieta iperlipidica. Con il cDNA ottenuto sono stati eseguiti esperimenti di amplificazione genica mediante PCR. Essi hanno dimostrato che le isoforme di CYP considerate e i recettori nucleari non sono modulati a livello genico da una dieta iperlipidica. Esperimenti di Western Blotting effettuati utilizzando anticorpi policlonali anti-CYP2E1, anti-CYP2C11 e anti-CYP4A1 di ratto, su campioni di fegato e rene di suino, hanno confermato 
anche a livello proteico la mancanza di modulazione da dieta iperlipidica evidenziata a livello<br>trascrizionale in questi due organi.<br>A livello di attività enzimatica, sono stati eseguiti alcuni saggi enzimatici su microsomi di<br>fegato, rene e duodeno dei suini di controllo e dei suini alimentati con dieta iperlipidica. Il<br>CYP2E1 è stato investigato in microsomi epatici e renali di suino utilizzando le attività<br>marcatrici p-nitrofenolo idrossilasi e anilina idrossilasi. L’attività del CYP4A è stata analizzata, in campioni di fegato e rene, mediante la quantificazione dei metaboliti ω e ω-1 che si formano in seguito alla idrossilazione dell’acido laurico. Le attività tolbutamide idrossilasi e 7-metossi-4-trifluorometilcumarina-O-demetilasi (MFCOD), entrambe marcatrici di alcune isoforme di CYP2C, sono state condotte su microsomi di fegato, rene e duodeno. L’attività enzimatica testosterone idrossilasi, marcatrice di varie isoforme di CYP, ha permesso di investigare l’attività di tali isoforme in campioni epatici e renali tramite la quantificazione di alcuni metaboliti. Infine<br>sono state eseguite le attività enzimatiche etossiresorufina-O-deetilasi (EROD), 7-etossi-4-<br>trifluorometilcumarina-O-deetilasi<br>(EFCOD) e benzilossichinolina debenzilasi<br>(BQD), marcatrici rispettivamente di isoforme appartenenti alle sottofamiglie CYP1A, CYP2B e<br>CYP3A. I risultati ottenuti hanno mostrato un aumento significativo dell’attività p-nitrofenolo in campioni epatici di suini alimentati con dieta iperlipidica; tuttavia tale induzione non è stata riscontrata a livello genico e proteico, probabilmente a causa di meccanismi post-trascrizionali che regolano<br>l’espressione del CYP2E1. La somministrazione della dieta iperlipidica ha inoltre determinato,<br>come riportato per roditori e uomo, una tendenza alla riduzione, in campioni epatici, delle attività tolbutamide idrossilasi e MFCOD, entrambe marcatrici dei CYP2C. Diversamente da quanto visto in ratti con steatosi dieta-indotta, nessuna variazione significativa è stata riscontrata per quanto riguarda l’attività acido laurico idrossilasi. In conclusione, diversamente dai roditori, in cui la somministrazione di una dieta iperlipidica ha determinato una profonda modulazione degli enzimi del drug metabolism, l’effetto riscontrato nel suino è risultato molto più debole. Questa scarsa modulazione potrebbe essere stata causata da molteplici fattori tra cui la durata troppo breve della dieta, la giovane età dei suini o la refrattarietà dei suini stessi agli effetti di una dieta iperlipidica sull’espressione del citocromo<br>P450.
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