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Tesi etd-09082017-105422


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
CULICCHI, ALESSANDRO
URN
etd-09082017-105422
Title
Identificazione morfologica e genetica del gambero di fiume Austropotamobius italicus (FAXON, 1914) in Lunigiana
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
CONSERVAZIONE ED EVOLUZIONE
Commissione
relatore Prof. Barbanera, Filippo
relatore Prof. Petroni, Giulio
relatore Dott.ssa Boschetti, Matilde
correlatore Prof. Maltagliati, Ferruccio
correlatore Dott. Baldaccini, Gilberto Natale
Parole chiave
  • mitochondrial DNA
  • Austropotamobius
  • white-clawed crayfish
  • conservation
  • Lunigiana
  • DNA mitocondriale
  • Austropotamobius
  • gambero di fiume
  • Lunigiana
  • conservazione
Data inizio appello
25/09/2017;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
25/09/2020
Riassunto analitico
Il gambero di fiume, il complesso di specie sorelle Austropotamobius pallipes, è il più grande invertebrato vagile delle acque temperate interne in Italia, e rappresenta un complesso chiave, ombrello e bandiera ad elevata priorità di conservazione. Tra i simbionti associati a tale complesso di specie figurano i Branchiobdellidi (Annelida: Clitellata). L’area di studio della presente tesi è la Lunigiana (Provincia di Massa-Carrara), che comprende il bacino idrografico del fiume Magra. Gli obiettivi del presente lavoro sono: investigare la presenza ed il pattern di distribuzione del gambero di fiume nei torrenti dell’alta valle del fiume Magra, in Lunigiana; identificare le unità tassonomiche ivi presenti, sia tramite criteri morfologici che tramite DNA barcoding; inferire la struttura genetica delle popolazioni rinvenute nell’area di studio, per ottenere informazioni circa la loro variabilità genetica e le loro relazioni con popolazioni conspecifiche allopatriche; identificare la/le specie di branchiobdellidi eventualmente rinvenute sui gamberi. Un transetto di 500 m è stato selezionato e percorso in sette torrenti della Lunigiana, investigati da due a sette volte tra Marzo ed Ottobre 2016 per valutare visivamente e tramite ispezione dei rifugi la presenza del gambero. In totale sono stati campionati 148 individui (gamberi vivi, esuvie e uova). Dove possibile, sono stati misurati alcuni parametri biometrici (lunghezza del carapace, LC; rapporto tra lunghezza dell’apice del rostro e quella del rostro, AR/R), è stato prelevato un pereiopode e sono stati raccolti branchiobdellidi simbionti. È stato estratto il DNA genomico da 60 campioni di gambero e da 10 branchiobdellidi. Mediante reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, PCR) e analisi delle lunghezze dei frammenti amplificati, i gamberi sono stati investigati a 10 loci microsatellitari. Tramite PCR e sequenziamento, è stato anche analizzato un frammento del gene mitocondriale per la subunità I della citocromo c ossidasi (COI) in un sottocampione di 36 gamberi (1.173 paia di basi, pb) e in tutti i branchiobdellidi (564 pb). Le sequenze di COI dei gamberi e dei branchiobdellidi sono state allineate con altre disponibili nel National Center for Biotechnology Information (da qui in avanti, GenBank). Tra le elaborazioni statistiche effettuate con i dati microsatellitari figurano il calcolo delle frequenze alleliche, l’elaborazione di una matrice con gli indici di fissazione FST tra popolazioni e sottopopolazioni, la verifica dell’Equilibrio di Hardy-Weinberg (HWE) e la cluster analysis con il metodo bayesiano. Con le sequenze della COI si è calcolata la distanza genetica tra le popolazioni rinvenute in Lunigiana ed altri gruppi di sequenze (gamberi e branchiobdellidi), oltre ad elaborare degli alberi filogenetici di tipo bayesiano (gamberi e branchiobdellidi) ed un network aplotipico (gamberi). Il gambero di fiume è stato rinvenuto in due torrenti, il Verdesina e il Civasola. Le analisi morfometriche hanno classificato la specie come A. italicus (AR/R) e hanno evidenziato dimensioni significativamente maggiori nei gamberi del Civasola rispetto a quelli del Verdesina (LC). Per quanto riguarda i microsatelliti, il numero di alleli rinvenuti per locus varia tra 1 e 10. I valori degli indici FST tra le sottopopolazioni dei due fiumi Verdesina e Civasola sono compresi tra 0,013 e 0,639. Entrambe le popolazioni si discostano significativamente da HWE, e la cluster analysis assegna ciascun individuo a due cluster differenti, corrispondenti ai due torrenti. Per ciò che concerne la COI, sono stati rinvenuti tre aplotipi di gambero di fiume nel Civasola ed uno nel Verdesina. Il network e gli alberi ricostruiti hanno permesso di classificare le sequenze di gambero da noi ottenute come A. i. carinthiacus (distanza genetica vs sequenze GenBank compresa tra 0,008 e 0,083). I branchiobdellidi sono stati rinvenuti nel torrente Verdesina (quattro aplotipi appartenenti alla specie Branchiobdella italica, distanza genetica vs sequenze GenBank compresa tra 0,039 e 0,251). Il presente lavoro di tesi ha permesso di identificare la sottospecie di gambero di fiume A. i. carinthiacus in due torrenti lunensi sui sette considerati. Le popolazioni dei due fiumi presentano scarsa variabilità genetica intra-popolazione ed un significativo livello di differenziazione reciproca. In uno dei due torrenti con gambero di fiume, sono stati individuati branchiobdellidi appartenenti alla specie B. italica. In conclusione, possiamo affermare che la Lunigiana rappresenta un’area con popolazioni vitali di gambero di fiume: la conservazione di questa risorsa e la protezione del suo habitat sono pertanto fortemente auspicabili alla luce della tendenza di riduzione dell’areale di distribuzione della specie.<br><br>The white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes is the largest vagile invertebrate living in the Italian internal waters. It is considered a keystone, umbrella and flagship species complex, which is known to be often associated with branchiobdellids (Annelida: Clitellata) according to symbiotic relationships. In this thesis, we investigated white-clawed crayfish populations resident in Lunigiana (Province of Massa-Carrara), which includes the Magra river catchment area. The aim of our work is to (i) investigate white-clawed crayfish occurrence and distribution pattern in the streams of the upper part of the Magra river catchment area; (ii) identify taxonomic units occurring in the study area according to both morphological criteria and DNA barcoding; (iii) infer the genetic structure of the studied populations for purpose of comparison with allopatric crayfish of the same species; (iv) identify potentially occurring symbiotic branchiobdellids. A 500 m-long transect was investigated in seven streams two to seven times between March and October 2016. We evaluated the occurrence of crayfish by carefully inspecting the body of the watercourse as well as possible refuges. We collected 148 samples (alive crayfish, exuviae and eggs) and, whenever possible, we either measured biometric parameters (carapace length, LC; ratio between rostrum acumen length and rostrum length, AR/R) or sampled a single pereiopod together with branchiobdellids. DNA was extracted from 60 crayfish and 10 branchiobdellids. Crayfish were investigated at 10 microsatellite loci by means of Polymerase Chain Reaction (PCR) and fragment length analysis. A fragment from the subunit I of the mitochondrial DNA Cytochrome c Oxidase (COI) gene was investigated by PCR and direct sequencing in a subsample of 36 crayfish (1,173 base pairs, bp) and in all branchiobdellids (564 bp). Sequences were aligned with many others downloaded from the National Center for Biotechnology Information (from now on, GenBank) for both crayfish and branchiobdellids. As far as the microsatellites are concerned, we computed the allelic frequencies and created a fixation indices (FST) matrix including subpopulations. We performed the Hardy-Weinberg Equilibrium test (HWE) as well as a Bayesian cluster analysis. We calculated the mtDNA COI distance among the Lunigiana populations and allopatric crayfish and branchiobdellids retrieved from the GenBank. Moreover, Bayesian phylogenetic trees (crayfish and branchiobdellids) and a haplotype network (crayfish) were constructed. The white-clawed crayfish was found in two rivers, Verdesina and Civasola. Morphometric analyses assigned the investigated individuals to the species A. italicus (AR/R) and showed that the Civasola crayfish are significantly larger than the Verdesina ones (LC). With reference to the microsatellites, the number of alleles per locus ranged between 1 and 10. The FST values among the subpopulations of Verdesina and Civasola were comprised between 0.013 and 0.639. Both populations significantly departed from the HWE and the cluster analysis assigned crayfish to two different clusters, each corresponding to one out of the two investigated streams. With reference to the mtDNA, three and one crayfish haplotypes were detected in the Civasola and Verdesina streams, respectively. The network and the phylogenetic reconstructions concurrently assigned both crayfish populations to the subspecies A. i. carinthiacus (genetic distances vs the GenBank sequences ranging between 0.008 and 0.083). Branchiobdellids were found in the Verdesina stream only (four haplotypes belonging to the species Branchiobdella italica, with the genetic distances vs the GenBank sequences ranging between 0.039 and 0.251). In conclusion, this work allowed us to identify the white-clawed crayfish subspecies A. i. carinthiacus in two out of the seven investigated streams. We disclosed genetically low intra-stream variability and significantly high divergence between Civasola and Verdesina populations. In conclusion, Lunigiana hosts healthy and genetically intact white-clawed crayfish populations. Hence, the preservation of the white-clawed crayfish as well as of its habitat deserves attention especially in the light of the progressive reduction of the distribution range of this species.
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