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Tesi etd-09052011-100249


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
BARSOTTI, MATTEO
URN
etd-09052011-100249
Title
ANALISI DI METILAZIONE DEL PROMOTORE DEI GENI hMLH1, MGMT, APC e RASSF1A IN PAZIENTI AFFETTI DA CANCRO AL COLON-RETTO TRAMITE LA TECNICA MS-HRM (METHYLATION SENSITIVE HIGH RESOLUTION MELTING)
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Commissione
relatore Prof.ssa Migliore, Lucia
Parole chiave
  • metiilazione
  • epigenetica
  • cancro
  • colon
  • RASSF1A
  • APC
  • MGMT
  • hMLH1
Data inizio appello
29/09/2011;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
29/09/2051
Riassunto analitico
Il cancro al colon retto (CRC) è la seconda causa di morte dopo il tumore alla mammella nella donna e il tumore al polmone nell’uomo e il suo tasso d’incidenza è maggiore nei paesi industrializzati. Esistono due principali sindromi ereditarie ovvero la sindrome poliposica familiare (FAP) e la sindrome di Lynch, le quali sono correlate con lo sviluppo del cancro al colon retto. I principali fattori di rischio legati all’insorgenza di questa patologia sono diversi: infiammazioni intestinali croniche, stile di vita, età, dieta povera di vegetali, obesità, sesso ed etnia del soggetto. Il CRC risulta da un accumulo di alterazioni genetiche ed epigenetiche. Quest’ultime non determinano cambiamenti nella sequenza nucleotidica ma piuttosto comprendono eventi come la metilazione del DNA la quale è in grado di modulare l’espressione genica. Diversi studi in letteratura riportano una possibile correlazione tra un alterato grado di metilazione nel promotore di geni soppressori tumorali, proto-oncogeni, geni coinvolti nella riparazione del DNA e il rischio di CRC; inoltre, in associazione con questa malattia, è stata osservata una ipometilazione globale del DNA soprattutto in presenza di una dieta povera di folati. Una carenza di folati è stata inoltre maggiormente associata ad un elevato rischio di sviluppare il cancro al colon se in presenza di iperomocisteinemia. Questo lavoro di tesi fa parte di uno studio in cui si sono valutati lo stato di metilazione nel promotore dei geni hMLH1 (human-mut L Homologue 1), MGMT (0-6-Methylguanine DNA methyl transferase), APC (Adenomatous Polyposis Coli) e RASSF1A (Ras association domain family 1) in diversi tessuti di 28 pazienti affetti da CRC sporadico. E’ stata effettuata l’estrazione del DNA da sangue periferico, da tessuto tumorale e tessuto adiacente sano dei pazienti reclutati. L’analisi di metilazione è stata eseguita mediante la tecnica Methylation-Sensitive/ High Resolution Melting (MS-HRM) utilizzando primer indipendenti dalla metilazione (MIP). A tale scopo, il DNA estratto è stato trattato con bisolfito di sodio per convertire le citosine non metilate in uracile e lasciare inalterate le 5-metilcitosine. Dopo aver effettuato l’amplificazione i campioni sono stati dunque sottoposti all’analisi di melting così da rendere possibile la distinzione dei frammenti di DNA metilati da quelli non metilati grazie al confronto con le curve di melting di alcuni standard rappresentativi delle diverse percentuali di metilazione. I campioni che hanno mostrato percentuali di metilazione diverse dallo 0% sono stati, per tutti i geni presi in considerazione, quelli del tessuto tumorale e rispettivamente hMLH1 ha mostrato percentuali di metilazione in circa il 15% di essi, MGMT in circa il 30%, APC in circa il 50% e RASSF1A in circa il 20%. Questo lavoro di tesi è solo una piccola parte di un progetto che intende, una volta aumentato il numero dei pazienti, correlare da una parte la percentuale di metilazione sul promotore dei geni analizzati con la loro relativa espressione e dall’altra con i livelli ematici di acido folico, omocisteina (i cui livelli sono per gran parte dei pazienti analizzati sopra alla norma), vitamina B12 e i polimorfismi dei geni coinvolti nel pathway dell’acido folico al fine di comprendere quanto i fattori di suscettibilità genetica, connessi con quelli del rischio ambientale come la dieta e lo stile di vita (indagati tramite questionari), possano incidere sull’aumento della probabilità che si verifichi il CRC. <br>
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