Thesis etd-09032005-102005 |
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Thesis type
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Author
Bertini, Fulvia
URN
etd-09032005-102005
Thesis title
AICA riboside induce apoptosi in cellule di neuroblastoma umano attraverso la via mitocondriale.
Department
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Course of study
SCIENZE BIOLOGICHE
Supervisors
relatore Dott.ssa Garcia Gil, Maria De Las Mercedes
Keywords
- via mitocondriale
- AICA riboside
- apoptosi
Graduation session start date
03/10/2005
Availability
Full
Summary
E' stato precedentemente dimostrato che l'incubazione prolungata con 5'-amminoimidazolo-4-carbossammide (AICA) riboside produce frammentazione nucleare ed attivazione della caspasi-3 nelle cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y, caratteristiche tipiche dell’apoptosi. L’AICA riboside è in grado di entrare nella cellula e, per mezzo dell’enzima adenosina chinasi, esser fosforilato nel citosol a ribotide il quale mima la AMP e porta all'attivazione della proteina chinasi attivata da AMP (AMPK). La AMPK appartenente alla famiglia delle serina-treonina chinasi, è considerata un sensore dei livelli di energia cellulare in molti tessuti. La AMPK, attivata per fosforilazione sul residuo amminoacidico Thr172 della subunità a, regola processi di consumo e di rigenerazione di ATP in condizioni fisiologiche normali (come la contrazione muscolare scheletrica e cardiaca sia a riposo che durante l’esercizio) e in condizioni patologiche (come lo stress metabolico, l’ipossia, l’ischemia, la deprivazione da glucosio). Non è chiaro il ruolo che la AMPK svolga nell’apoptosi; alcuni Autori hanno riportato la sua attivazione durante la morte cellulare programmata mentre altri l'hanno descritta come coinvolta nel meccanismo di protezione da essa.
Lo scopo della presente tesi è chiarire il meccanismo di apoptosi indotto da AICA riboside. La via mitocondriale è caratterizzata dal rilascio di citocromo c mitocondriale al citosol, dove si lega alla proteina Apaf 1 e provoca l'attivazione della caspasi 9. Per chiarire se l'apoptosi indotta da AICA riboside, coinvolga la via mitocondriale, sono stati evidenziati il rilascio del citocromo c e l'attivazione della caspasi 9 mediante western blotting: estratti di cellule trattate a vari tempi con AICA riboside e di colture di controllo, sono stati sottoposti a SDS-PAGE, trasferiti su membrana PVDF ed infine incubati con anticorpi appropriati. Abbiamo osservato che le modificazioni di morfologia nucleare sono precedute dal rilascio di citocromo C e dall’attivazione di caspasi-9.
Nell'intento di capire se l'attivazione della AMPK sia coinvolta nel meccanismo della citotossicità, abbiamo incubato le cellule di neuroblastoma con un altro stimolatore della AMPK, la metformina, o con un inibitore, il composto C. L’attività della AMPK è stata saggiata attraverso la tecnica del western blotting, usando un anticorpo anti-AMPK fosforilata, per rilevarne la presenza. La vitalità cellulare è stata misurata eseguendo il saggio dell’MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio)) e la morfologia nucleare è stata analizzata al microscopio a fluorescenza dopo la colorazione con Hoechst.
Trattamenti di AICA riboside o metformina producono attivazione della AMPK rilevabile già dopo 3-5 ore. Trattamento con metformina 5 mM per 72 ore riducono la vitalità cellulare e inducono la comparsa di corpi apoptotici. Il composto C non produce protezione quando l’apoptosi è indotta da AICA riboside nelle cellule di neuroblastoma. Questo suggerisce che l’attività di AMPK deve essere finemente regolata, perché sia la stimolazione che l’inibizione della AMPK riducono la vitalità.
AICA riboside potrebbe accumularsi in individui con un errore innato del metabolismo delle purine che causi un aumento nella sintesi de novo e/o una sovraespressione della 5’-nucleotidasi (l'enzima che trasforma il ribotide in riboside). I risultati della presente tesi suggeriscono che l'effetto tossico di AICA riboside su alcuni tipi di neuroni può partecipare alle manifestazioni neurologiche di sindromi correlati con disfunzioni del metabolismo purinico.
Lo scopo della presente tesi è chiarire il meccanismo di apoptosi indotto da AICA riboside. La via mitocondriale è caratterizzata dal rilascio di citocromo c mitocondriale al citosol, dove si lega alla proteina Apaf 1 e provoca l'attivazione della caspasi 9. Per chiarire se l'apoptosi indotta da AICA riboside, coinvolga la via mitocondriale, sono stati evidenziati il rilascio del citocromo c e l'attivazione della caspasi 9 mediante western blotting: estratti di cellule trattate a vari tempi con AICA riboside e di colture di controllo, sono stati sottoposti a SDS-PAGE, trasferiti su membrana PVDF ed infine incubati con anticorpi appropriati. Abbiamo osservato che le modificazioni di morfologia nucleare sono precedute dal rilascio di citocromo C e dall’attivazione di caspasi-9.
Nell'intento di capire se l'attivazione della AMPK sia coinvolta nel meccanismo della citotossicità, abbiamo incubato le cellule di neuroblastoma con un altro stimolatore della AMPK, la metformina, o con un inibitore, il composto C. L’attività della AMPK è stata saggiata attraverso la tecnica del western blotting, usando un anticorpo anti-AMPK fosforilata, per rilevarne la presenza. La vitalità cellulare è stata misurata eseguendo il saggio dell’MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio)) e la morfologia nucleare è stata analizzata al microscopio a fluorescenza dopo la colorazione con Hoechst.
Trattamenti di AICA riboside o metformina producono attivazione della AMPK rilevabile già dopo 3-5 ore. Trattamento con metformina 5 mM per 72 ore riducono la vitalità cellulare e inducono la comparsa di corpi apoptotici. Il composto C non produce protezione quando l’apoptosi è indotta da AICA riboside nelle cellule di neuroblastoma. Questo suggerisce che l’attività di AMPK deve essere finemente regolata, perché sia la stimolazione che l’inibizione della AMPK riducono la vitalità.
AICA riboside potrebbe accumularsi in individui con un errore innato del metabolismo delle purine che causi un aumento nella sintesi de novo e/o una sovraespressione della 5’-nucleotidasi (l'enzima che trasforma il ribotide in riboside). I risultati della presente tesi suggeriscono che l'effetto tossico di AICA riboside su alcuni tipi di neuroni può partecipare alle manifestazioni neurologiche di sindromi correlati con disfunzioni del metabolismo purinico.
File
Nome file | Dimensione |
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Abstract.pdf | 88.05 Kb |
Bibliografia.pdf | 128.59 Kb |
DISCUSSIONE.pdf | 114.78 Kb |
Elencoab...zioni.pdf | 70.64 Kb |
Indice.pdf | 94.63 Kb |
INTRODUZIONE.pdf | 907.67 Kb |
MATERIALI_METODI.pdf | 149.07 Kb |
Riassunto.pdf | 86.61 Kb |
RISULTATI.pdf | 403.03 Kb |
ScopoTesi.pdf | 47.48 Kb |
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