ETD system

Electronic theses and dissertations repository

 

Tesi etd-09032005-102005


Thesis type
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Author
Bertini, Fulvia
URN
etd-09032005-102005
Title
AICA riboside induce apoptosi in cellule di neuroblastoma umano attraverso la via mitocondriale.
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE
Commissione
relatore Dott.ssa Garcia Gil, Maria De Las Mercedes
Parole chiave
  • apoptosi
  • via mitocondriale
  • AICA riboside
Data inizio appello
03/10/2005;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
E&#39; stato precedentemente dimostrato che l&#39;incubazione prolungata con 5&#39;-amminoimidazolo-4-carbossammide (AICA) riboside produce frammentazione nucleare ed attivazione della caspasi-3 nelle cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y, caratteristiche tipiche dell’apoptosi. L’AICA riboside è in grado di entrare nella cellula e, per mezzo dell’enzima adenosina chinasi, esser fosforilato nel citosol a ribotide il quale mima la AMP e porta all&#39;attivazione della proteina chinasi attivata da AMP (AMPK). La AMPK appartenente alla famiglia delle serina-treonina chinasi, è considerata un sensore dei livelli di energia cellulare in molti tessuti. La AMPK, attivata per fosforilazione sul residuo amminoacidico Thr172 della subunità a, regola processi di consumo e di rigenerazione di ATP in condizioni fisiologiche normali (come la contrazione muscolare scheletrica e cardiaca sia a riposo che durante l’esercizio) e in condizioni patologiche (come lo stress metabolico, l’ipossia, l’ischemia, la deprivazione da glucosio). Non è chiaro il ruolo che la AMPK svolga nell’apoptosi; alcuni Autori hanno riportato la sua attivazione durante la morte cellulare programmata mentre altri l&#39;hanno descritta come coinvolta nel meccanismo di protezione da essa. <br>Lo scopo della presente tesi è chiarire il meccanismo di apoptosi indotto da AICA riboside. La via mitocondriale è caratterizzata dal rilascio di citocromo c mitocondriale al citosol, dove si lega alla proteina Apaf 1 e provoca l&#39;attivazione della caspasi 9. Per chiarire se l&#39;apoptosi indotta da AICA riboside, coinvolga la via mitocondriale, sono stati evidenziati il rilascio del citocromo c e l&#39;attivazione della caspasi 9 mediante western blotting: estratti di cellule trattate a vari tempi con AICA riboside e di colture di controllo, sono stati sottoposti a SDS-PAGE, trasferiti su membrana PVDF ed infine incubati con anticorpi appropriati. Abbiamo osservato che le modificazioni di morfologia nucleare sono precedute dal rilascio di citocromo C e dall’attivazione di caspasi-9. <br>Nell&#39;intento di capire se l&#39;attivazione della AMPK sia coinvolta nel meccanismo della citotossicità, abbiamo incubato le cellule di neuroblastoma con un altro stimolatore della AMPK, la metformina, o con un inibitore, il composto C. L’attività della AMPK è stata saggiata attraverso la tecnica del western blotting, usando un anticorpo anti-AMPK fosforilata, per rilevarne la presenza. La vitalità cellulare è stata misurata eseguendo il saggio dell’MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio)) e la morfologia nucleare è stata analizzata al microscopio a fluorescenza dopo la colorazione con Hoechst.<br>Trattamenti di AICA riboside o metformina producono attivazione della AMPK rilevabile già dopo 3-5 ore. Trattamento con metformina 5 mM per 72 ore riducono la vitalità cellulare e inducono la comparsa di corpi apoptotici. Il composto C non produce protezione quando l’apoptosi è indotta da AICA riboside nelle cellule di neuroblastoma. Questo suggerisce che l’attività di AMPK deve essere finemente regolata, perché sia la stimolazione che l’inibizione della AMPK riducono la vitalità. <br>AICA riboside potrebbe accumularsi in individui con un errore innato del metabolismo delle purine che causi un aumento nella sintesi de novo e/o una sovraespressione della 5’-nucleotidasi (l&#39;enzima che trasforma il ribotide in riboside). I risultati della presente tesi suggeriscono che l&#39;effetto tossico di AICA riboside su alcuni tipi di neuroni può partecipare alle manifestazioni neurologiche di sindromi correlati con disfunzioni del metabolismo purinico. <br>
File