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Archivio digitale delle tesi discusse presso l'Università di Pisa

Tesi etd-07032014-182450


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
DONATI, SWAN
URN
etd-07032014-182450
Titolo
Utilità diagnostica della rivelazione di infezioni multiple, carica virale ed integrazione del papillomavirus umano quali fattori prognostici nello screening secondario del carcinoma della cervice uterina.
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI E INDUSTRIALI
Relatori
relatore Dott.ssa Bianchi, Loria
relatore Prof. Landi, Stefano
Parole chiave
  • HPV
  • HPV16
  • genotipizzazione
  • carica virale
  • integrazione
  • infezioni multiple
  • confronto tra metodi
  • controllo di cellularità
  • viral load
  • integration status
  • multiple infection
  • methods comparison
  • cellularity control
  • genotyping
Data inizio appello
21/07/2014
Consultabilità
Completa
Riassunto
Introduzione. L’infezione da Papillomavirus Umano (Human Papilloma Virus, HPV) rappresenta la malattia virale a trasmissione sessuale più comune (Markovitz et al, 2007). È ormai consolidato il dato che pressoché il 100% di tutti i tumori della cervice uterina sono causati da un’infezione persistente del virus HPV (Guo et al., 2007) e che circa il 70% dei tumori cervicali sono causati dai genotipi 16 (55-60%) e 18 (10-15%) (Muñoz et al., 2004; Saslow et al., 2012). Poiché gran parte delle infezioni, anche con genotipi ad alto rischio oncogeno (HR-HPV), sono transienti, è emersa la necessità di identificare altri marcatori HPV-correlati in grado di individuare correttamente le donne con rischio elevato di sviluppare lesioni di alto grado. La genotipizzazione, la quantificazione della carica virale e del grado di integrazione sono fra i possibili candidati. L’integrazione del DNA virale nel genoma ospite, quando avviene, comporta la delezione del gene virale E2, importante fattore di regolazione della trascrizione delle proteine oncogeniche virali E6 ed E7 (Manawapat et al., 2012). I numerosi studi presenti in letteratura evidenziano dati contrastanti sul ruolo della carica e dell’integrazione nello sviluppo delle lesioni citologiche/istologiche della cervice uterina e scarsi sono i dati riguardo al ruolo delle infezioni multiple nella progressione neoplastica.
Scopo della tesi. Gli scopi di questo studio sono stati: a) valutare sensibilità, specificità e concordanza nei risultati tra vari metodi di genotipizzazione del virus HPV (PCR end-point e Real Time PCR); b) valutare il possibile ruolo prognostico di marcatori quali: 1) determinazione del genotipo; 2) presenza di infezioni multiple; 3) carica virale (limitatamente all’HPV16); 4) grado di integrazione virale (limitatamente all’HPV16).
Materiali e metodi. La casistica analizzata è costituita da pazienti afferenti alla U.O. Anatomia Patologica dell’ospedale di Pistoia per eseguire il test HPV come test di secondo livello, ed in particolare: 415 campioni ThinPrep con alterazioni citologiche (76 campioni ASC-US – Cellule squamose atipiche di incerto significato, 225 L-SIL – Lesioni intraepiteliali di basso grado, 55 ASC-H – Cellule squamose atipiche non escludenti lesioni intraepiteliali di alto grado e 59 H-SIL – Lesioni intraepiteliali di alto grado); i rispettivi 415 campioni istologici (116 senza alterazioni, 168 con lesione CIN – Neoplasia intraepiteliale cervicale - di grado 1, 81 con lesione CIN2, 46 con lesione CIN3 e 4 carcinomi) e 172 campioni citologici negativi di controllo. Il DNA dei campioni, estratto utilizzando il kit EZ1 Virus Mini v2.0 (Qiagen) con l’estrattore automatico EZ1 Advanced (Qiagen), è stato successivamente amplificato per la rilevazione e genotipizzazione dell’HPV mediante PCR end-point e rivelazione con ibridazione inversa su striscia (AB Analitica, Innogenetics). L’idoneità del prelievo e la cellularità del campione è stata determinata mediante amplificazione con Real Time PCR (RT-PCR) quantitativa del gene umano HPRT1 (Cell Control r-gene, Biomerieux). La misurazione della carica di HPV 16 è stata effettuata mediante quantificazione in RT-PCR delle copie del gene virale E6 (Peitsaro et al., 2002) e calcolata in rapporto al numero di cellule. La percentuale di genoma virale integrato è stata calcolata come la differenza tra le copie del gene E6 (presente sia in forma episomale sia integrata) e del gene E2 (presente solo in forma episomale) in rapporto alla carica totale.
Risultati. Il valore medio di cellularità ottenuto nei campioni citologici e istologici è rispettivamente 3.517.097 ± 354.518 cell/prelievo e 10.852 ± 836 cell/vetrino. Le due metodiche di genotipizzazione basate sull’ibridazione inversa su striscia, INNOLiPA HPV Genotyping Extra (Innogenetics) e AMPLIQUALITY HPV Type Express v.2.0 (AB ANALITICA) hanno una sensibilità ed una specificità rispettivamente di 94% vs 99% e specificità del 100%. Le metodiche RealTime PCR valutate, Dx HR-HPV Auto Assay (BIO-RAD),Uterine Cervix Cancer of High-risk HPV Genotype Related Real-time PCR (Liferiver) e RealLine HPV High Risk Gentotype Fla-Format (BIORON) hanno una sensibilità paragonabile (>95%). La specificità rilevata è stata rispettivamente del 95%, 91% e 85%. Dall’analisi statistica effettuata con il Mc Nemar’s test risulta che non ci sono differenze statisticamente significative (p>0.05) tra i genotipi rilevati con tutte e 5 le metodiche di genotipizzazione valutate. La frequenza di positività globale all’HPV aumenta all’aumentare della gravità della lesione sia citologica che istologica (χ2, p < 0,005), così come la prevalenza degli HR-HPV (χ2, p < 0,005). L’HPV 16 risulta il genotipo più frequentemente rilevato nelle alterazioni citologiche e istologiche (22,9% e 35,59%) con Odds Ratio (OR) significativi per le lesioni ASC-H (OR = 2,26; IC 95% = 1,43-3,55), H-SIL (OR = 4,81; IC 95% = 3,19-7,24), CIN2 (OR = 2,59; IC 95% = 1,8-3,72) e CIN3+ (OR = 5,94; IC 95% = 3,83-9,19). Le coinfezioni totali nei campioni citologici (25% dei campioni positivi) variano significativamente al variare della lesione (χ2, p < 0,005), con un’incidenza più alta rilevata negli ASC-US (56%) e più bassa nelle lesioni di alto grado (7% ASC-H e 12% H-SIL). I campioni ASC-US con coinfezioni HR-HR all’analisi istologica sono risultati per il 55% CIN1 e per il 45% CIN2. Nei campioni istologici la frequenza delle coinfezioni è del 28% con variazioni statisticamente significative tra le varie lesioni (χ2, p < 0,005): le percentuali più alte sono rilevate nei CIN1 e CIN2 (34% e 41%), mentre risultano meno frequenti nei CIN3 (8%). Nessuna coinfezione è stata rilevata nei carcinomi. Nei campioni citologici la categoria L-SIL risulta quella con la carica virale più elevata con una media di 273 ± 57 copie/cellula, mentre la carica più bassa risulta nei campioni negativi di controllo (0,35 ± 0,06 copie/cellula). La carica virale diminuisce all’aumentare del grado di lesione istologica rilevata successivamente con prelievo bioptico (R2 = 0,81). Nei campioni istologici la carica virale più elevata è rilevata nelle lesioni CIN1 con una media di 669 ± 271 copie/cellula; essa diminuisce poi all’aumentare della lesione (R2 = 0,9562). La carica rilevata nei carcinomi è paragonabile a quella rilevata nei campioni senza alterazioni (39 ± 13 vs 30 ± 8 copie/cellula). Le cariche misurate nei campioni istologici sono superiori di circa 100 volte rispetto a quelle misurate nei rispettivi campioni citologici, e direttamente correlate (R2=0,99). Non risultano differenze statisticamente significative nel grado di integrazione virale tra le varie classi di lesione citologica, mentre aumenta significativamente nelle lesioni CIN2+ quando misurato nel campione bioptico (t di Student, p < 0,005). Nei campioni citologici gradi di integrazione virale superiori al 50% sono associati significativamente a cariche inferiori a 1 copia/cellula (χ2, p < 0,005).
Conclusioni. Dai nostri dati emerge che: a) come atteso, la prevalenza dei genotipi ad alto rischio aumenta all’aumentare del grado di lesione sia citologica che istologica; b) rilevare le infezioni multiple HR-HR negli stadi precoci di alterazione citologica (ASC-US e L-SIL) è un fattore prognostico di lesione. Tale dato è confermato all’istologia dove le coinfezioni HR-HR aumentano all’aumentare della lesione, fino a CIN2. Da qui nasce l’importanza della genotipizzazione anche per le pazienti con lesioni di basso grado in quanto, se positive a infezioni multiple, risultano soggette a sviluppare lesioni pre-cancerose; c) la rilevazione di basse cariche di HPV16 in campioni citologici con anomalie è indice di lesione istologiche gravi, dato confermato dalla diminuzione della carica al progredire della lesione istologica; d) la rilevazione contemporanea di una bassa carica di HPV 16 e di un elevato grado di integrazione virale è indice di lesione di alto grado. Da qui l’importanza di eseguire studi più approfonditi per confermare il valore prognostico di un’integrazione elevata ed una carica bassa tale da permetterne un’utilità nella selezione di donne con elevato rischio di progressione.
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