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Tesi etd-07022013-161517


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
PIRASTU, GIULIA
URN
etd-07022013-161517
Title
Preparazione e caratterizzazione di nanoparticelle polimeriche per il rilascio di molecole ad attivita' antimicrobica
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Supervisors
relatore Dott.ssa Chiellini, Federica
relatore Dott.ssa Piras, Anna Maria
Parole chiave
  • Nanoparticelle polimeriche
  • nanomedicina
  • antimicrobici
  • chitosano
Data inizio appello
18/07/2013;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
18/07/2053
Riassunto analitico
Le nanoparticelle polimeriche sono sistemi colloidali ampiamente studiati in nanomedicina per il rilascio controllato di peptidi, proteine, chemioterapici ed acidi nucleici. Rispetto alle convenzionali forme farmaceutiche offrono notevoli vantaggi tra cui il parziale controllo della farmacocinetica, la riduzione della tossicità sistemica e l’aumento della biodisponibilità del principio attivo. Tra i polimeri utilizzati per la realizzazione di sistemi nanoparticellari, riveste particolare importanza il chitosano, un polimero semi-sintetico costituito da unità di N-acetil-D-glucosammina e D-glucosammina, ottenuto dalla deacetilazione della chitina, un polisaccaride ampiamente diffuso in natura (es. esoscheletro di insetti e crostacei, parete cellulare di funghi). Il chitosano mostra una buona solubilità in soluzioni acquose acide, è biodegradabile e biocompatibile ed in virtù della sua natura cationica è dotato di proprietà antimicrobiche. Il presente lavoro di tesi, volto alla preparazione e caratterizzazione di nanoparticelle polimeriche per il rilascio di molecole ad attività antimicrobica, si inserisce in un progetto di ricerca mirato allo sviluppo di sistemi nanoparticellari a base di chitosano per il rilascio controllato e mirato di peptidi ad attività antimicrobica (AMP), da utilizzare nel trattamento di infezioni sostenute da specie batteriche antibiotico-resistenti come ad esempio quelle coinvolte nella formazione dei biofilm sui dispositivi biomedici. Gli AMP sono piccoli peptidi cationici ed anfipatici con una spiccata attività antibatterica contro un ampio spettro di patogeni antibiotico-resistenti. Il loro impiego terapeutico è però limitato dalla loro bassa stabilità nei fluidi biologici e dalla loro potenziale tossicità in vivo; caratteristiche che possono essere migliorate con l’ausilio di forme a rilascio modificato.
La prima fase del lavoro di tesi è stata incentrata sulla realizzazione di un modello sperimentale basato su nanoparticelle di chitosano caricate con lisozima, un enzima con attività antimicrobica utilizzato come farmaco proteico modello. Nonostante l’origine commerciale del chitosano impiegato nella formulazione delle nanoparticelle, è stato necessario caratterizzare il materiale da un punto di vista chimico-fisico per poter identificare con maggior esattezza, rispetto alle indicazioni fornite dalla casa produttrice, le proprietà del chitosano acquistato e metterle in relazione con le proprietà delle formulazioni sviluppate. La cromatografia a permeazione su gel (GPC) è stata impiegata per determinare il peso molecolare (PM); l’analisi termogravimetrica (TGA) ha permesso l’identificazione della teperatura di degradazione; il grado di deacetilazione (DD) è stato calcolato con tre diversi metodi basati su calorimetria differenziale a scansione (DSC), spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier (FT-IR) e spettroscopia UV-vis. I risultati hanno evidenziato che il chitosano commerciale impiegato nelle formulazioni di nanoparticelle ha un PM ponderale di 108 kDa, temperatura di degradazione pari a 264°C e DD superiore al 92%.
Le nanoparticelle a base di chitosano caricate con lisozima sono state preparate mediante gelificazione ionotropica utilizzando come agente reticolante il tripolifosfato. La caratterizzazione dimensionale dei nanoformulati preparati, condotta mediante Light Scattering Dinamico (DLS), ha mostrato un diametro medio inferiore ai 200 nm. L’analisi della carica superficiale delle nanoparticelle, condotta mediante misura del potenziale Zeta, ha permesso di evidenziare il parziale adsorbimento del lisozima sulla superficie delle nanoparticelle. L’efficienza di caricamento ed il loading del lisozima, investigati mediante spettrofotometria UV-vis., sono risultati rispettivamente del 10% e 9%, e la cinetica di rilascio dell’enzima in condizioni fisiologiche ha evidenziato un profilo di rilascio caratterizzato da un burst inziale del lisozima seguito da un rilascio prolungato nel tempo.
In collaborazione con il gruppo di ricerca della Prof.ssa Giovanna Batoni del Dipartimento di Ricerca Traslazionale e delle Nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia, sono state effettuate delle prove preliminari per valutare l’attività battericida delle nanoparticelle preparate su Staphylococcus epidermidis. I risultati hanno permesso di individuare due concentrazioni di nanoparticelle caricate con lisozima (75µg/ml; 37.5 µg/ml) a cui l’azione battericida del sistema nanoparticellare è maggiore, in maniera statisticamente significativa, rispetto all’attività del principio attivo libero e delle nanoparticelle a base di solo CS.
Infine, la valutazione della citocompatibilità dei sistemi sviluppati, condotta in vitro utilizzando la linea di fibroblasti murini embrionali balb/3T3 clone A31, ha evidenziato una buona biocompatibilità delle stesse.
La seconda parte del lavoro di tesi è stata incentrata sulla preparazione di nanoparticelle a base di CS caricate con un peptide modello (RS1) al fine di ottimizzare i parametri formulativi per l'ottenimento di sistemi nanostrutturati caricati con AMP. La gelificazione ionotropica per preparare le nanoparticelle caricate con RS1 è stata condotta a diversi valori di pH (3 e 5) in modo da ottimizzare l’interazione tra il peptide caricato e la matrice polimerica. Le nanoparticelle ottenute, caratterizzate da un diametro medio inferiore ai 200 nm, hanno mostrato un efficienza di caricamento elevata del peptide modello RS1, che si avvicina al 100% per i campioni formulati ad un valore di pH di 5. Le formulazioni realizzate nel presente lavoro di tesi potranno essere ulteriormente sviluppate con la messa a punto di un saggio con elevata sensibilità per la quantificazione e la valutazione del rilascio del peptide caricato e la sostituzione del peptide modello con l’AMP di interesse terapeutico.
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