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Tesi etd-07012016-135717


Thesis type
Tesi di specializzazione (5 anni)
Author
CIRAOLO, ANNA
URN
etd-07012016-135717
Title
Caratterizzazione di calibratori per il dosaggio delle catene leggere libere plasmatiche in nefelometria
Struttura
RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
PATOLOGIA CLINICA
Commissione
relatore Caponi, Laura
Parole chiave
  • calibratori
  • nefelometria
  • catene leggere libere
Data inizio appello
19/07/2016;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
19/07/2019
Riassunto analitico
Le catene leggere libere costituiscono, fin dalla loro scoperta, oggetto di grande interesse scientifico. La loro determinazione quantitativa, che ha ormai assunto un ruolo consolidato nella diagnosi, nella prognosi e nel monitoraggio di diverse discrasie plasmacellulari, sembra coinvolgere nuovi ambiti clinici come le malattie autoimmunitarie, quelle degenerative del sistema nervoso centrale e le allergopatie (Basile U et Mussap M, 2013). <br>Per il dosaggio delle catene leggere libere in campioni di siero o plasma sono attualmente disponibili due reagenti, The Binding Site Freelite e Siemens N Latex FLC. Il primo impiega un metodo immunoturbidimetrico o nefelometrico amplificato al lattice utilizzando anticorpi policlonali di pecora tollerizzata; il secondo si serve di un metodo immunonefelometrico amplificato al lattice utilizzando una miscela di anticorpi monoclonali murini. Purtroppo, la mancanza di armonizzazione tra i risultati ottenuti con questi due metodi commerciali non consente di trasferire le conoscenze acquisite con l’impiego del primo reattivo a quelle ottenute con il secondo (Caponi L et al, 2016; Mollee P et al, 2013; Dolci A et Vernocchi A, 2012). <br>Al fine di comprendere meglio la capacità di legame dei due reattivi, è stato deciso di caratterizzare i calibratori impiegati nei reattivi Freelite Human Kappa e Freelite Human Lambda (The Binding Site) per il contenuto di catene leggere libere di tipo kappa e di tipo lambda. Questi sono stati sottoposti ad analisi di Western Blotting dopo separazione elettroforetica in SDS-PAGE eseguita in condizioni non riducenti e le catene leggere sono state evidenziate impiegando anticorpi primari diretti contro le catene leggere kappa e lambda totali. Sui calibratori è stata quindi eseguita una cromatografia ad esclusione molecolare, e sulle frazioni ottenute sono state dosate le catene leggere libere kappa e lambda con i reattivi Freelite Human Kappa e Freelite Human Lambda (The Binding Site) in nefelometria prima e dopo l’aggiunta del DTT (Ditiotreitolo), un agente riducente i ponti disolfuro. I risultati ottenuti sono stati confermati da analisi di Western Blotting e suggeriscono la presenza di catene leggere a più alto peso molecolare, che rappresentano verosimilmente forme di aggregazione quali dimeri, trimeri o oligomeri di ordine superiore che scompaiono per dar luogo a forme a più basso peso molecolare dopo trattamento con DTT. I ponti disolfuro intercatena potrebbero quindi influenzare la reattività degli antiseri utilizzati. <br>
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