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Tesi etd-07012015-173646


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM6
Author
CANU, ALESSIO
URN
etd-07012015-173646
Title
Effetto dell'estetrolo sulla sintesi di ossido nitrico in cellule endoteliali umane
Struttura
RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
MEDICINA E CHIRURGIA
Supervisors
relatore Prof. Simoncini, Tommaso
Parole chiave
  • estetrolo
  • estradiolo
  • ER
  • NO
  • eNOS
  • HUVEC
Data inizio appello
21/07/2015;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
21/07/2018
Riassunto analitico
L’uomo e la donna presentano fisiologie e malattie diverse tra di loro, questo concetto è riconosciuto universalmente, ma per molto tempo abbiamo basato buona parte dello studio e della terapia esclusivamente sul maschio. Queste differenze tra i due sessi sono legate a vari motivi, come le diverse concentrazioni di estrogeni. Gli estrogeni sono responsabili di numerose azioni sul ciclo ovarico e mestruale, sulla vagina e sul tessuto osseo, sul sistema nervoso centrale e sui sintomi della menopausa; inoltre questi ormoni influenzano la malattia cardiovascolare, principale causa di morbilità e mortalità nel mondo.
L’incidenza e la prevalenza di patologie cardiovascolari nella donna cambiano anche in base al periodo di vita: in età fertile sono meno frequenti grazie alla protezione data dagli estrogeni; questi ormoni incidono sul profilo metabolico e prevengono le dislipidemie, che favoriscono l'insorgenza di aterosclerosi. Nel postmenopausa calano gli estrogeni, l'assetto metabolico peggiora e si formano in tutto l’albero vascolare placche aterosclerotiche, che aumentano il rischio di eventi cardiovascolari. L’aterosclerosi è riconosciuta come una possibile causa d’infarto miocardico, ictus ischemico, arteriopatia periferica.
Gli estrogeni oltre ad essere prodotti dall'organismo possono essere assunti per via esogena con la terapia estroprogestinica (la comune "pillola") per diversi motivi: dalle irregolarità mestruali alla sindrome dell'ovaio policistico, dall'endometriosi alla menopausa fino ad altre applicazioni. La pillola è costituita da due componenti, una progestinica e una estrogenica che è rappresentata dall'etinilestradiolo (EE), una molecola sintetica ottenuta dall'estradiolo, ma negli ultimi anni si sta cercando di sostituirlo con una molecola dotata della stessa azione terapeutica, priva di effetti collaterali. Una molecola nuova, attualmente sotto studio, potrebbe essere l'estetrolo (E4).
L’E4 è una molecola di produzione epatica fetale, rintracciabile a livelli dosabili nel feto e nella donna in gravidanza, le sue concentrazioni calano rapidamente dopo il parto. Il suo ruolo non è stato ancora chiarito, ma da diversi studi eseguiti su ratti ovariectomizzati (OVX) si è capito che l'E4 ha azione su diversi tessuti: sull'ovaio ha un effetto antiovulatorio e riduce la secrezione di gonadotropine, sull'utero ha un'azione trofica e proliferativa, sulla vagina favorisce il processo di corneificazione, sul tessuto osseo rallenta il processo di perdita e demineralizzazione, inoltre previene le variazioni termiche (indotte con il naloxone) che imitano i flushing cutanei associati alla menopausa. Nel 2008 sono stati eseguiti i primi studi clinici su donne in età fertile e in menopausa: anche nella donna l'estetrolo è ben tollerato, non sembra avere effetti collaterali. L'E4 riduce la frequenza dei flushing, i livelli di gonadotropine e ha azione sulla vagina; queste osservazioni supportano l'idea di un ipotetico uso nella contraccezione orale e nella terapia sostitutiva.
Tra il 2014 e il 2015 sono stati eseguiti dei trial basati sulle osservazioni di studi precedenti. I risultati ottenuti hanno evidenziato come l’E4 ha anche azione antiproliferativa sulle cellule di tumore mammario umano: l'ormone ha attività antiestrogenica, riduce la trascrizione del recettore estrogenico α (ERα) e aumenta quella dell’ERβ, aumenta l’espressione della proteina legante gli ormoni sessuali (SHBG) che lega l'E2 e ne riduce la quota libera; inoltre quando viene somministrato con l’E2 ne antagonizza l'effetto proliferativo sulle cellule tumorali mammarie umane.
Uno studio del 2012 condotto su ratti OVX ha dimostrato l'effetto vasorilassante dell'E4 su arterie pre--contratte. Queste azioni sono il risultato di meccanismi che coinvolgono gli ER, la guanilato ciclasi (enzima che produce il guanosina monofosfato ciclico, cGMP) e l’inibizione delle correnti ioniche del calcio entranti nelle cellule muscolari lisce della tonaca media vasale. L’ossido nitrico (NO) aumenta la sintesi di cGMP, che a sua volta favorisce il rilassamento delle cellule muscolari lisce vasali. A sua volta l’NO viene prodotto a livello endoteliale attraverso l’ossido nitrico sintetasi endoteliale (eNOS), è noto da tempo come gli estrogeni agiscano su queste due molecole.
L'NO vasodilata e ha azione antiaggregante, gioca un ruolo importantissimo nella malattia cardiovascolare perché nel processo di formazione della placca aterosclerotica il primo evento è dato dalla disfunzione endoteliale: a causa del fumo, dell'ipertensione o del calo di estrogeni la produzione endoteliale di NO e di prostacicline si riduce; come risultato c’è vasocostrizione. L’endotelio diventa adesivo per macrofagi, neutrofili e piastrine, si depositano LDL nel subendotelio e si richiamano macrofagi, con la formazione finale di un ateroma. Il processo coinvolge tutto l’albero vascolare, è responsabile di stenosi e può essere complicato da eventi acuti che possono essere causa d’infarto, ictus e altre malattie cardiovascolari.
L'effetto dell'E2 sull'espressione e sull'attività dell'eNOS è stato indagato in altri studi, ma sull'E4 possiamo basarci solo sull’osservazione che ha azione vaso dilatante sulle arterie murine. Per questo nell'elaborato, che si inserisce in un progetto di ricerca in fase di pubblicazione, è stato valutato l'effetto dell'E4 sulla sintesi di NO, sull'attività e sull'espressione dell’eNOS in un altro modello: le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC).
Le HUVEC sono state isolate dai cordoni ombelicali raccolti e poi stimolate con l'E4, da solo e con l'E2; in seguito è stata misurata l'espressione di nitriti per valutare la sintesi di NO, l’espressione dell’eNOS in forma inattiva e attiva (p-eNOS). L'E4, in misura minore dell'E2, favorisce la sintesi dell'NO, l'attività e l’espressione dell’eNOS.
In seguito è stato osservato il comportamento dell'eNOS e dell’NO con la somministrazione contemporanea di E2 ed E4, visto che il secondo è un modulatore dell'azione del primo; per questo sono state usate tre concentrazioni diverse di questo ormone, 10-8 M, 10-9 M e 10-10 M: queste tre dosi mimano rispettivamente quelle della donna nelle prime settimane di gravidanza, della fase preovulatoria e del postmenopausa. I risultati ottenuti sembrano suggerire che l'E4 modula l'azione dell'E2 in maniera diversa secondo le concentrazioni di quest’ultimo ormone. Si osserva che l’effetto di modulazione dell’attività, dell’espressione dell’eNOS e della sintesi di NO dipendenti dall’E2 è massimo con concentrazioni di E2 di 10-8 M, 10-9 M, mentre è minimo con dosi di 10-10 M; il motivo di questo particolare comportamento non è stato totalmente chiarito. Tutti i risultati fin qui illustrati sono stati ottenuti su cellule incubate per 48 ore con i suddetti ormoni.
Le vie che l'estetrolo potrebbe sfruttare per attivare l’eNOS sono diverse e per capire quali vengono usate è stata effettuata una somministrazione rapida (30 minuti) di E2 ed E4. Sono stati studiati nelle cellule il rilascio di nitriti, l’attività dell’eNOS; sul lisato cellulare l’espressione di varie proteine: eNOS, p-eNOS, Akt e p-Akt. Il rilascio di NO e l’attività dell’eNOS aumentano, non l'espressione della proteina eNOS: questo suggerisce il coinvolgimento di vie di segnalazione extranucleari. Queste modalità di segnalazione sfruttano la fosfatidil-3-OH-chinasi (PI3K) e la serina-treonina chinasi Akt. La p-Akt aumenta come risposta alla somministrazione di E4, quindi la via PI3K/Akt sembra essere coinvolta nella stimolazione dell'E4 sull’eNOS e sulla sintesi di NO.
Infine è stato osservato l'effetto dell'E4 sull'espressione della p-eNOS e della p-Akt indotte dall'E2: i loro livelli calano notevolmente quando sono sfruttate concentrazioni di estradiolo di 10-8 M, 10-9 M, mentre rimangono inalterati con dosi di 10-10 M.
Sulle cellule trattate con l’E4 a 48 ore e a 30 minuti è stato utilizzato l’ICI 182,780, antagonista dell'ERα: tutte le azioni dell’E4 sull’eNOS e sulla p-eNOS in questo modello sperimentale vengono ridotte nettamente, cosa che suggerisce il possibile ma non unico coinvolgimento degli ER.
In conclusione i risultati ottenuti ci fanno supporre che l'E4 modula la sintesi di NO nelle cellule endoteliali umane della vena ombelicale, interferisce sulla sintesi di NO indotta dall'E2 e, per attivare l’eNOS, potrebbe coinvolgere la via di segnalazione ER extranucleare.
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