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Tesi etd-07012015-173646


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM6
Author
CANU, ALESSIO
URN
etd-07012015-173646
Title
Effetto dell'estetrolo sulla sintesi di ossido nitrico in cellule endoteliali umane
Struttura
RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
MEDICINA E CHIRURGIA
Commissione
relatore Prof. Simoncini, Tommaso
Parole chiave
  • estetrolo
  • estradiolo
  • ER
  • NO
  • eNOS
  • HUVEC
Data inizio appello
21/07/2015;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
21/07/2018
Riassunto analitico
L’uomo e la donna presentano fisiologie e malattie diverse tra di loro, questo concetto è riconosciuto universalmente, ma per molto tempo abbiamo basato buona parte dello studio e della terapia esclusivamente sul maschio. Queste differenze tra i due sessi sono legate a vari motivi, come le diverse concentrazioni di estrogeni. Gli estrogeni sono responsabili di numerose azioni sul ciclo ovarico e mestruale, sulla vagina e sul tessuto osseo, sul sistema nervoso centrale e sui sintomi della menopausa; inoltre questi ormoni influenzano la malattia cardiovascolare, principale causa di morbilità e mortalità nel mondo. <br>L’incidenza e la prevalenza di patologie cardiovascolari nella donna cambiano anche in base al periodo di vita: in età fertile sono meno frequenti grazie alla protezione data dagli estrogeni; questi ormoni incidono sul profilo metabolico e prevengono le dislipidemie, che favoriscono l&#39;insorgenza di aterosclerosi. Nel postmenopausa calano gli estrogeni, l&#39;assetto metabolico peggiora e si formano in tutto l’albero vascolare placche aterosclerotiche, che aumentano il rischio di eventi cardiovascolari. L’aterosclerosi è riconosciuta come una possibile causa d’infarto miocardico, ictus ischemico, arteriopatia periferica.<br>Gli estrogeni oltre ad essere prodotti dall&#39;organismo possono essere assunti per via esogena con la terapia estroprogestinica (la comune &#34;pillola&#34;) per diversi motivi: dalle irregolarità mestruali alla sindrome dell&#39;ovaio policistico, dall&#39;endometriosi alla menopausa fino ad altre applicazioni. La pillola è costituita da due componenti, una progestinica e una estrogenica che è rappresentata dall&#39;etinilestradiolo (EE), una molecola sintetica ottenuta dall&#39;estradiolo, ma negli ultimi anni si sta cercando di sostituirlo con una molecola dotata della stessa azione terapeutica, priva di effetti collaterali. Una molecola nuova, attualmente sotto studio, potrebbe essere l&#39;estetrolo (E4). <br>L’E4 è una molecola di produzione epatica fetale, rintracciabile a livelli dosabili nel feto e nella donna in gravidanza, le sue concentrazioni calano rapidamente dopo il parto. Il suo ruolo non è stato ancora chiarito, ma da diversi studi eseguiti su ratti ovariectomizzati (OVX) si è capito che l&#39;E4 ha azione su diversi tessuti: sull&#39;ovaio ha un effetto antiovulatorio e riduce la secrezione di gonadotropine, sull&#39;utero ha un&#39;azione trofica e proliferativa, sulla vagina favorisce il processo di corneificazione, sul tessuto osseo rallenta il processo di perdita e demineralizzazione, inoltre previene le variazioni termiche (indotte con il naloxone) che imitano i flushing cutanei associati alla menopausa. Nel 2008 sono stati eseguiti i primi studi clinici su donne in età fertile e in menopausa: anche nella donna l&#39;estetrolo è ben tollerato, non sembra avere effetti collaterali. L&#39;E4 riduce la frequenza dei flushing, i livelli di gonadotropine e ha azione sulla vagina; queste osservazioni supportano l&#39;idea di un ipotetico uso nella contraccezione orale e nella terapia sostitutiva. <br>Tra il 2014 e il 2015 sono stati eseguiti dei trial basati sulle osservazioni di studi precedenti. I risultati ottenuti hanno evidenziato come l’E4 ha anche azione antiproliferativa sulle cellule di tumore mammario umano: l&#39;ormone ha attività antiestrogenica, riduce la trascrizione del recettore estrogenico α (ERα) e aumenta quella dell’ERβ, aumenta l’espressione della proteina legante gli ormoni sessuali (SHBG) che lega l&#39;E2 e ne riduce la quota libera; inoltre quando viene somministrato con l’E2 ne antagonizza l&#39;effetto proliferativo sulle cellule tumorali mammarie umane. <br>Uno studio del 2012 condotto su ratti OVX ha dimostrato l&#39;effetto vasorilassante dell&#39;E4 su arterie pre--contratte. Queste azioni sono il risultato di meccanismi che coinvolgono gli ER, la guanilato ciclasi (enzima che produce il guanosina monofosfato ciclico, cGMP) e l’inibizione delle correnti ioniche del calcio entranti nelle cellule muscolari lisce della tonaca media vasale. L’ossido nitrico (NO) aumenta la sintesi di cGMP, che a sua volta favorisce il rilassamento delle cellule muscolari lisce vasali. A sua volta l’NO viene prodotto a livello endoteliale attraverso l’ossido nitrico sintetasi endoteliale (eNOS), è noto da tempo come gli estrogeni agiscano su queste due molecole.<br>L&#39;NO vasodilata e ha azione antiaggregante, gioca un ruolo importantissimo nella malattia cardiovascolare perché nel processo di formazione della placca aterosclerotica il primo evento è dato dalla disfunzione endoteliale: a causa del fumo, dell&#39;ipertensione o del calo di estrogeni la produzione endoteliale di NO e di prostacicline si riduce; come risultato c’è vasocostrizione. L’endotelio diventa adesivo per macrofagi, neutrofili e piastrine, si depositano LDL nel subendotelio e si richiamano macrofagi, con la formazione finale di un ateroma. Il processo coinvolge tutto l’albero vascolare, è responsabile di stenosi e può essere complicato da eventi acuti che possono essere causa d’infarto, ictus e altre malattie cardiovascolari. <br>L&#39;effetto dell&#39;E2 sull&#39;espressione e sull&#39;attività dell&#39;eNOS è stato indagato in altri studi, ma sull&#39;E4 possiamo basarci solo sull’osservazione che ha azione vaso dilatante sulle arterie murine. Per questo nell&#39;elaborato, che si inserisce in un progetto di ricerca in fase di pubblicazione, è stato valutato l&#39;effetto dell&#39;E4 sulla sintesi di NO, sull&#39;attività e sull&#39;espressione dell’eNOS in un altro modello: le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC).<br>Le HUVEC sono state isolate dai cordoni ombelicali raccolti e poi stimolate con l&#39;E4, da solo e con l&#39;E2; in seguito è stata misurata l&#39;espressione di nitriti per valutare la sintesi di NO, l’espressione dell’eNOS in forma inattiva e attiva (p-eNOS). L&#39;E4, in misura minore dell&#39;E2, favorisce la sintesi dell&#39;NO, l&#39;attività e l’espressione dell’eNOS.<br>In seguito è stato osservato il comportamento dell&#39;eNOS e dell’NO con la somministrazione contemporanea di E2 ed E4, visto che il secondo è un modulatore dell&#39;azione del primo; per questo sono state usate tre concentrazioni diverse di questo ormone, 10-8 M, 10-9 M e 10-10 M: queste tre dosi mimano rispettivamente quelle della donna nelle prime settimane di gravidanza, della fase preovulatoria e del postmenopausa. I risultati ottenuti sembrano suggerire che l&#39;E4 modula l&#39;azione dell&#39;E2 in maniera diversa secondo le concentrazioni di quest’ultimo ormone. Si osserva che l’effetto di modulazione dell’attività, dell’espressione dell’eNOS e della sintesi di NO dipendenti dall’E2 è massimo con concentrazioni di E2 di 10-8 M, 10-9 M, mentre è minimo con dosi di 10-10 M; il motivo di questo particolare comportamento non è stato totalmente chiarito. Tutti i risultati fin qui illustrati sono stati ottenuti su cellule incubate per 48 ore con i suddetti ormoni.<br>Le vie che l&#39;estetrolo potrebbe sfruttare per attivare l’eNOS sono diverse e per capire quali vengono usate è stata effettuata una somministrazione rapida (30 minuti) di E2 ed E4. Sono stati studiati nelle cellule il rilascio di nitriti, l’attività dell’eNOS; sul lisato cellulare l’espressione di varie proteine: eNOS, p-eNOS, Akt e p-Akt. Il rilascio di NO e l’attività dell’eNOS aumentano, non l&#39;espressione della proteina eNOS: questo suggerisce il coinvolgimento di vie di segnalazione extranucleari. Queste modalità di segnalazione sfruttano la fosfatidil-3-OH-chinasi (PI3K) e la serina-treonina chinasi Akt. La p-Akt aumenta come risposta alla somministrazione di E4, quindi la via PI3K/Akt sembra essere coinvolta nella stimolazione dell&#39;E4 sull’eNOS e sulla sintesi di NO. <br>Infine è stato osservato l&#39;effetto dell&#39;E4 sull&#39;espressione della p-eNOS e della p-Akt indotte dall&#39;E2: i loro livelli calano notevolmente quando sono sfruttate concentrazioni di estradiolo di 10-8 M, 10-9 M, mentre rimangono inalterati con dosi di 10-10 M.<br>Sulle cellule trattate con l’E4 a 48 ore e a 30 minuti è stato utilizzato l’ICI 182,780, antagonista dell&#39;ERα: tutte le azioni dell’E4 sull’eNOS e sulla p-eNOS in questo modello sperimentale vengono ridotte nettamente, cosa che suggerisce il possibile ma non unico coinvolgimento degli ER. <br>In conclusione i risultati ottenuti ci fanno supporre che l&#39;E4 modula la sintesi di NO nelle cellule endoteliali umane della vena ombelicale, interferisce sulla sintesi di NO indotta dall&#39;E2 e, per attivare l’eNOS, potrebbe coinvolgere la via di segnalazione ER extranucleare.
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