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Tesi etd-07012007-134246


Thesis type
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Author
Donati, Elisa
URN
etd-07012007-134246
Title
MODULAZIONE DELL’ATTIVITA’DEI RECETTORI GLICOPROTEICI INDOTTA DA STEROIDI
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE
Commissione
Relatore Giorgi, Franco
Parole chiave
  • LH
  • FSH
  • cAMP
  • G Protein
  • hCG
  • FSHr
  • TSH
  • LHr
Data inizio appello
16/07/2007;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
16/07/2047
Riassunto analitico
Da lavori precedenti è emerso che la molecola 1,1,1-trichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethane, noto<br>come DDT, interferisce con la funzione tiroidea. In questo lavoro di tesi si è voluto indagare su<br>quale sia il meccanismo con cui la molecola del DDT determina tale interferenza.<br>Il legame dell’ormone ipofisario TSH al suo recettore, appartenente alla famiglia dei recettori<br>glicoproteici associati a proteine G, causa un incremento dell’attività dell’enzima adenilato ciclasi<br>che si traduce in un aumento della quantità di AMP ciclico (cAMP). Da studi su cellule esprimenti<br>il recettore per il TSH e trattate con 1,1,1-trichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethane, si è compreso<br>che l’azione di questa molecola è diretta su questo recettore. In particolare,mediante prove<br>funzionali di attività dell’enzima adenilato ciclasi,si è potuto notare che il DDT inibisce l’accumulo<br>di cAMP in cellule Chinese hamster ovary (CHO)-K1 stabilmente trasfettate con il recettore TSH<br>(TSHr), sia quello indotto dall’attività basale del recettore, sia quando il recettore è stimolato con<br>TSH bovino (bTSH). Inoltre si è osservato che la digestione del dominio extracellulare (ECD) con<br>tripsina o la rimozione dell’ECD come nel mutante TSHr trunk non contrastano l’attività inibitoria<br>esercitata dal DDT.<br>Per valutare la specificità dell’azione del DDT nei confronti del recettore per il TSH sono state<br>condotte prove funzionali di attività dell’enzima adenilato ciclasi in cellule CHO K1 e COS 7<br>(African green monkey kidney fibroblast ) stimolate con il Forskolin, che è un attivatore di tutte le<br>ciclasi. In questo caso il DDT esercita una debole inibizione nei confronti della stimolazione indotta<br>da Forskolin, mentre non determina alcuna inibizione in cellule trasfettate stabilmente con il<br>recettore dopaminergico D1 e adenosinico A2a stimolati rispettivamente con dopamina e 5’-(Nethyl-<br>carboxamido)-adenosine (NECA). Inoltre il trattamento con DDT non esercita alcun effetto<br>sul recettore Beta2 adrenergico endogenamente espresso nelle cellule COS-7. Questi risultati<br>confermano la specificità d’azione del DDT verso il recettore per il TSH e suggeriscono l’ipotesi<br>che il DDT possa avere un ruolo come agonista inverso non competitivo nei confronti del recettore<br>per il TSH. L’effetto inibitorio del DDT è stato osservato per concentrazioni nell’ordine del<br>micromolare alto; tale concentrazione normalmente non viene raggiunta quando questa sostanza<br>viene usata come insetticida. Il passo successivo è stato quello di ricercare analoghi del DDT con<br>attività inibitoria sul recettore, ma efficaci per concentrazioni più basse. Dall’attività di screening di<br>varie molecole analoghe come per esempio il dietilstilbestrolo ed altre, quella più attiva è risultata<br>essere la Quercetin A, che è un fitosteroide. Da questi risultati abbiamo capito che la componente<br>steroidea è importante per l’inibizione. Così abbiamo iniziato a studiare l’effetto dell’estradiolo<br>sulla induzione di cAMP da parte di tutti i recettori per gli ormoni glicoproteici. Quello che<br>abbiamo osservato è che il beta-estradiolo è il più potente inibitore dell’attività dei recettori<br>glicoproteici LH e FSH.<br>Ulteriori studi sono stati condotti per approfondire il meccanismo di inibizione del DDT e altri<br>steroidi sui recettori glicoproteici. In particolare, in base a uno studio (Hoffman et al. Nature 2005)<br>condotto su recettori accoppiati a proteine G, è stato messo a punto un protocollo sperimentale che<br>utilizza la capacità di un composto arsenicato (Flash) di diventare fluorescente a seguito del suo<br>legame con un sequenza di soli sei aminoacidi. Modificando la sequenza del nostro recettore TSHr<br>con l’aggiunta della sequenza bersaglio è stato ottenuto un recettore chimerico funzionante che è<br>stato trasfettato nelle Cos7 transientemente per poter valutare l’attività e la capacità<br>effettiva di legare Flash, e quindi di permettere la evidenziazione dell recettore. Il vantaggio di questa tecnica<br>consiste nell’ovviare al problema dell’ingombro sterico di proteine fluorescenti attaccate al<br>recettore; i comuni cromofori sono proteine di dimensioni piuttosto grandi che spesso<br>compromettono l’attività e impediscono la corretta localizzazione dei recettori. Le piccole<br>dimensioni di FlAsH non causano tali inconvenienti.
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