ETD system

Electronic theses and dissertations repository

 

Tesi etd-06282013-121437


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
TURCHI, BARBARA
URN
etd-06282013-121437
Title
Valutazione della sicurezza e del potenziale tecnologico di batteri lattici isolati da pecorini tradizionali prodotti in Toscana
Settore scientifico disciplinare
VET/05
Corso di studi
SCIENZE AGRARIE E VETERINARIE
Commissione
tutor Prof. Cerri, Domenico
Parole chiave
  • caratterizzazione tecnologica
  • biodiversità
  • batteri lattici
  • antibiotico-resistenza
  • Multilocus Sequence Typing
Data inizio appello
08/07/2013;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Il presente lavoro ha riguardato 54 ceppi di batteri lattici isolati da pecorini tradizionali toscani, prodotti a latte crudo, senza l’impiego di colture starter commerciali. I ceppi in esame erano suddivisi in 28 isolati appartenenti al genere Lactobacillus e 26 isolati appartenenti al genere Lactococcus. Nello specifico i ceppi appartenevano alle seguenti specie: Lc. lactis subsp. lactis (n=16), Lc. lactis subsp. cremoris (n=8), Lc. raffinolactis (n=2), Lb. paracasei (n=12) e Lb. plantarum (n=16). I ceppi ATCC334, ATCC20174 e ATCC19435 sono stati utilizzati come ceppi di referenza. Lo scopo della tesi è stato quello di caratterizzare, nella maniera il più completa possibile, tali microrganismi in modo da poterli utilizzare per la realizzazione di prodotti lattiero-caseari tradizionali.<br>I ceppi selezionati sono stati dapprima sottoposti a valutazione del profilo di antibiotico-resistenza mediante metodiche fenotipiche (diffusione su agar e microdiluizioni). Gli antibiotici presi in considerazione sono stati: ampicillina, vancomicina, gentamicina, kanamicina, streptomicina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina e cloramfenicolo. I ceppi resistenti sono stati sottoposti a PCR per la ricerca dei geni codificanti antibiotico-resistenza. Gli isolati sono stati successivamente sottoposti a caratterizzazione tecnologica (valutazione dell’attività acidificante, valutazione dell’attività proteolitica, resistenza a cloruro di sodio, resistenza al calore) e valutazione del profilo metabolico mediante sistemi miniaturizzati API. Infine, alcuni ceppi sono stati selezionati per un’indagine relativa alla biodiversità genotipica attraverso la metodica del Multilocus Sequence Typing (MLST).<br>In accordo con la recente bibliografia, il presente studio ha messo in evidenza che il fenomeno di antibiotico-resistenza risulta essere globalmente contenuto nell’ambito delle flore lattiche. Le maggiori percentuali di resistenza fenotipica sono state riscontrate per il genere Lactobacillus nei confronti di cloramfenicolo (66,66%), tetraciclina (46,66%), streptomicina (23,07%) e kanamicina (6,6%). Per quanto riguarda Lactococcus una bassa percentuale di ceppi resistenti è stata invece riscontrata per tetraciclina (11,11%). E’ stato possibile osservare un fenotipo resistente accompagnato da un riscontro positivo anche per la presenza di geni codificanti la resistenza nel 5,5% della popolazione studiata e relativamente a tetraciclina (3 Lc. lactis subsp. cremoris positivi per il gene tet(M)). Per quanto riguarda Lactobacillus spp è stata evidenziata una discrepanza tra i risultati ottenuti tramite metodo di Kirby-Bauer e metodo delle microdiluizioni, probabilmente attribuibile alla mancanza di corretti parametri per l’interpretazione dei risultati ottenuti mediante metodo di Kirby-Bauer e alla mancanza di valori di cut off uniformati per i due metodi fenotipici utilizzati. Le attività acidificanti e proteolitiche hanno presentato trend simili nell’ambito delle specie considerate: Lb. paracasei e Lc. lactis subsp. lactis hanno mostrato attività maggiori, mentre Lb. plantarum e Lc. lactis subsp. cremoris si sono mostrate globalmente meno acidificanti e meno proteolitiche, seppur con alcune eccezioni. Per quanto riguarda la resistenza a temperatura, tutti i ceppi sono stati in grado di tollerare 40°C e 43°C, solamente 2 Lc. lactis subsp.cremoris e 1 Lb. parcacasei tolleravano 45°C. Relativamente alla resistenza al sale tutti lattobacilli tolleravano 4,5% e 6% NaCl, mentre solo 8 ceppi erano in grado di sviluppare in presenza del 6,5% di NaCl. I lattococchi sono risultati essere invece sensibili già al 4,5% di NaCl, solo 8 ceppi sono stati infatti in grado di crescere, seppur debolmente al 6% NaCl. Sono stati, inoltre, osservati diversi profili API: per quanto riguarda Lb. plantarum tra i 16 ceppi studiati sono stati evidenziati 5 profili diversi; per i 12 ceppi Lb. paracasei sono stati osservati 7 profili; per i 16 ceppi di Lc. lactis subsp lactis 7 profili; per gli 8 ceppi di Lc. lactis subsp cremoris 5 profili ed infine i due ceppi di Lc. raffinolactis presentavano 2 diversi profili biochimici. L’analisi attraverso MLST ha rappresentato un valido strumento per raggiungere un’identificazione a livello di ceppo. Sono stati osservati ceppi con fenotipo diverso, ma al contempo dotati di uno stesso profilo ST. Al contrario ceppi che avevano caratteristiche metaboliche e tecnologiche sovrapponibili hanno presentato poi un genotipo diverso. La maggiore biodiversità genotipica è stata osservata tra i ceppi appartenenti alla specie Lb. paracasei (9 ceppi, 7 profili ST), mentre per Lc. lactis è stata osservata una minore variabilità (18 ceppi, 10 profili ST). Questa metodica consente quindi di poter eliminare eventuali ridondanze a livello di ceppoteca e poter offrire ai produttori dei ceppi diversi da utilizzare in programmi di rotazione in caseificio, anche in previsione di un’eventuale infezione fagica.<br>
File