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Tesi etd-06282010-135207


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
PICONE, LISA
URN
etd-06282010-135207
Title
Recettore GPR17: Interazione e regolazione tra il sito purinergico e il sito leucotrienico.
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
correlatore Dott.ssa Daniele, Simona
relatore Prof.ssa Trincavelli, Maria Letizia
Parole chiave
  • Nessuna parola chiave trovata
Data inizio appello
14/07/2010;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
14/07/2050
Riassunto analitico
Il recettore GPR17 è un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) che si ritrova filogeneticamente in una posizione intermedia tra i recettori purinergici (P2Y) e i recettori leucotrienici (CysLT). Diversamente dagli altri recettori accoppiati a proteine G, il GPR17 è un recettore “dualistico”, cioè in grado di rispondere selettivamente a due distinte classi di agonisti: i nucleotidi uridinici e cisteinil-leucotrieni. In cellule di astroglioma umano (1321N1) esperimenti il recettore umano hGPR17 è stata dimostrata una risposta concentrazione-dipendente a LTD4 e LTC4 (con LTC4 &gt;&gt; LTD4) e a UDP, UDP-glucosio e UDP-galattosio (con UDP-galattosio=UDP&gt;UDP-glucosio). I valori dell’EC50 (ovvero la concentrazione che da il 50% della risposta massima) per la stimolazione degli agonisti sono in accordo con le caratteristiche dei recettori CysLT e P2Y conosciuti, ed in particolare nell’ordine del nanomolare per i cisteinil-leucotrieni e del micromolare per i nucleotidi uridinici. <br>Il recettore GPR17 è stato ritrovato altamente espresso negli organi che tipicamente vanno incontro a danno. In modelli animali d’ischemia e di lesioni traumatiche al midollo spinale il GPR17 nelle prime fasi, sembra avere un ruolo nell’induzione di morte cellulare, mentre a partire da 48-72 ore il recettore GPR17 compare su cellule di microglia e macrofagi vicino alla zona lesionata, suggerendo che possa avere un ruolo nei meccanismi di riparazione del danno; infatti a questo punto le cellule progenitrici degli oligodendrociti che esprimono il GPR17 iniziano a proliferare nella zona lesa, facendo presupporre un inizio di rimielinizzazione. In entrambi i modelli di lesione, si è evidenziato che il GPR17 è presente in cellule staminali, precursori degli oligodendrociti, che maturando possono generare cellule mature, che producono mielina, sostanza che facilita la comunicazione fra neuroni, rinnovando l’assetto cellulare di un organismo, anche adulto. Da studi recenti è emerso che affinche un pre-oligodendrocita possa arrivare a completa maturazione, il recettore GPR17 deve essere down-regolato. Alla base di questo fenomeno sono stati ipotizzati processi di desensitizzazione recettoriale, indotta dagli stessi ligandi (purinergici e leucotrienici) endogeni per GPR17. <br>Il fenomeno della desensitizzazione recettoriale può essere distinta in due tipi: omologa (mediata dall’attivazione agonista-dipendente del proprio recettore) e eterologa (mediata dall’attivazione di un altro recettore). L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di indagare l’esistenza di un cross-talk funzionale tra il sito purinergico e quello leucotrienico sul recettore GPR17 e i fenomeni di desensitizzazione funzionale per tale recettore. A tal scopo è stata impiegata la metodica del binding [35S]GTPγS, che permette di misurare, l’attivazione delle proteine G in seguito al legame di un substrato al recettore accoppiato alle proteine G e il saggio per la determinazione dei livelli di cAMP mediante il metodo competitivo della binding protein. <br>Nel complesso i saggi di binding del GTPγS hanno dimostrato l&#39;esistenza di un cross-talk tra i due siti: l&#39;effetto sinergico del ligando leucotrienico (LTD4 ) al sito purinergico è evidenziabile solo per stimolazione submassimale del sito leucotrienico. L&#39;effetto invece del ligando purinergico (UDP-glucosio) sulle risposte evocate dall’agonista leucotrienico (LTD4) è sempre evidenziabile sia ad alti che a bassi livelli di stimolazione del sito purinergico stesso.<br>Per valutare l’esistenza di un’antagonismo crociato tra i due siti, è stato poi indagato se l‘antagonista purinergico potesse abolire la risposta dell’agonista leucotrienico e viceversa: il montelukast (antagonista del sito leucotrienico) e il cangrelor (antagonista del sito purinergico) non sono risultati capaci di antagonizzare la risposta dell’UDP-glucosio o del LTD4 rispettivamente, suggerendo che la presenza di tali antagonisti sul proprio sito non altera la struttura conformazionale del sito adiacente del recettore.<br>E’ stata poi valutata la desensitizzazione/resensitizzazione sia omologa che eterologa, del recettore GPR17 tramite misurazione della produzione di cAMP. La preincubazione delle cellule con UDP-glucosio 10µM o LTD4 10 nM ha indotto una desensitizzazione tempo-dipendente della risposta funzionale del GPR17, con una cinetica piuttosto lenta e un effetto massimale dopo 60-90’ di pre-incubazione con l’agonista. La desensitizzazione omologa, sia del sito purinergico che di quello leucotrienico, del GPR17 si è mostrata dipendente dalla concentrazione di agonista, con un effetto massimale a 100µM di UDP-glucosio e 100nM di LTD4. Il recupero della funzionalità del sito purinergico è risultata avere cinetica piuttosto lenta, tipica dei GPCR (dopo 120 minuti), a differenza di quella del sito leucotrienico, che è risultata più veloce (dopo 60 minuti).<br> E’ stato infine indagato se la stimolazione con UDP-glucosio del sito purinergico del GPR17 inducesse una desensitizzazione crociata del sito leucotrienico, o viceversa. Il pretrattamento delle cellule con UDP-glucosio a concentrazioni sub-massimali ha determinato una significativa riduzione della risposta di LTD4 suggerendo l’esistenza di una regolazione crociatra tra i due siti; se al contrario le cellule vengono trattate con LTD4 e successivamente stimolate con UDP-glucosio non si ha una riduzione della risposta di quest’ultimo, suggerendo che l’attivazione del sito leucotrienico non è in grado di desensitizzare la risposta agli agonisti purinergici. Inoltre, dopo desensitizzazione eterologa, il segnale del sito leucotrienico del GPR17 recupera dopo 90-120 minuti, più lentamente di ciò che accade durante la resensitizzazione omologa dello stesso sito.<br>In conclusione, i dati ottenuti sembrano avvalorare l’ipotesi che il recettore GPR17 presenti due differenti siti di legame, uno per gli agonisti purinergici e uno per quelli leucotrienici. Il recettore GPR17 va incontro a fenomeni di desensitizzazione e resensitizzazione, dipendenti da tempo di esposizione e concentrazione dell’agonista utilizzato. Le due classi di agonisti per il recettore GPR17 sono in grado di influenzare vicendevolmente le risposte di stimolazione del recettore, anche se in maniera diversa. In particolare, la stimolazione del sito purinergico è in grado di potenziare le risposte di attivazione e di indurre desensitizzazione del sito leucotrienico. Al contrario, la stimolazione del sito leucotrienico potenzia le risposte di attivazione del sito purinergico solo a concentrazioni sub-massimali, e non è in grado di grado di indurre desensitizzazione di tale sito.<br>Il fenomeno della desensitizzazione mostrata dal GPR17 potrebbe essere alla base della down-regolazione del recettore durante la maturazione degli oligodendrociti.<br><br><br>
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