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Tesi etd-06262015-221316


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
ROSSI, ALESSIA
URN
etd-06262015-221316
Title
Confronto tra approccio tradizionale e next-generation sequencing per la caratterizzazione delle comunità di ciliati
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
CONSERVAZIONE ED EVOLUZIONE
Supervisors
relatore Prof. Petroni, Giulio
relatore Dott. Boscaro, Vittorio
Parole chiave
  • illumina
  • miscroscopio
  • morfotipi
  • v4
Data inizio appello
20/07/2015;
Consultabilità
Completa
Riassunto analitico
Le comunità di protisti ciliati sono tradizionalmente studiate utilizzando approcci morfologici ai quali, negli ultimi anni, si sono affiancati metodi molecolari. Il presente lavoro ha lo scopo di caratterizzare le comunità di ciliati di ambienti dulciacquicoli naturali e antropizzati della provincia di Pistoia attraverso due diversi approcci: uno morfologico-molecolare di tipo tradizionale ed un secondo che sfrutta la tecnologia del next-generation sequencing (NGS).

L’attività di ricerca in oggetto ha interessato tre periodi di campionamento: autunno 2012, primavera 2013 e autunno 2013. I campionamenti sono stati effettuati in dieci aree all’interno della provincia di Pistoia per un totale di 29 siti di campionamento; l’area di studio comprende ambienti dulciacquicoli artificiali (lago di pesca sportiva, vasche di acquacoltura, laghetto dell’orto botanico) e naturali sia di tipo lentico (laghi e paludi) che lotico (torrenti). Da ogni sito di campionamento sono stati prelevati due campioni di acqua e sedimento; un campione è stato utilizzato per l’analisi in vivo mentre l’altro è stato fissato in etanolo per essere poi utilizzato nel secondo approccio di caratterizzazione. In ogni sito inoltre sono stati registrati alcuni parametri abiotici come temperatura, concentrazione di ossigeno, pH e salinità.

Nell’ambito del primo approccio, il campione appena raccolto è stato suddiviso in tre aliquote mantenute in condizioni differenti di nutrimento. Per ogni campione si è provveduto al riconoscimento dei diversi taxa di ciliati mediante osservazioni in vivo al tempo zero (giorno del campionamento) e dopo 1, 2, 3, e 5 settimane. Questo screening approfondito ha consentito di osservare anche una grossa parte della biodiversità criptica. Ove possibile è stato sequenziato il gene codificante il 18S rRNA per confermare l’identificazione morfologica degli organismi individuati.

L’approccio NGS ha previsto l’estrazione del DNA totale da 12 dei campioni fissati in etanolo e la successiva amplificazione della regione V4, una parte ipervariabile di circa 500 pb del gene codificante il 18S rRNA. I primer utilizzati sono stati ottimizzati per includere tutte le sequenze disponibili in banca dati afferenti al gruppo dei ciliati.
Questo secondo approccio si è avvalso del sequenziamento ad alta prestazione Illumina, che genera milioni di sequenze e richiede un’estesa analisi bioinformatica per l’interpretazione dei risultati. Questo tipo di analisi è stato attuato pochissime volte, finora, su comunità eucariotiche. Le sequenze appartenenti al gruppo dei ciliati sono state filtrate per qualità e raggruppate in OTU (Operational Taxonomic Unit).

La caratterizzazione delle comunità di ciliati attraverso i due metodi ha permesso di stilare due diverse check-list dei taxa presenti. I risultati sono stati analizzati con software statistici che hanno permesso di indagare la presenza di pattern caratteristici di biodiversità legati alla variabilità stagionale e ai parametri abiotici. Le conclusioni raggiunte con i due approcci indipendenti sono poi state confrontate per valutare vantaggi, svantaggi e differenze delle due metodologie.

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