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Composti di nuova sintesi per il traslocatore proteico mitocondriale (18kDa): valutazione biologica.


Riassunto


Il Traslocatore Proteico 18 kDa (TSPO) è una proteina ubiquitaria, coinvolta in numerosi processi biochimici, quali apoptosi, omeostasi cellulare, immunomodulazione etc. La sua espressione risulta particolarmente elevata nei tessuti deputati alla steroidogenesi e, infatti, il coinvolgimento di tale proteina nella biosintesi degli steroidi è noto e documentato. Il TSPO svolge un ruolo chiave nella tappa limitante della biosintesi degli steroidi e dei neurosteroidi (sintetizzati nelle cellule gliali), ovvero la trasformazione del colesterolo in pregnenolone: il TSPO permette il passaggio del colesterolo dalla membrana mitocondriale esterna a quella interna, dove verrà convertito ad opera del citocromo P450. Gli steroidi agiscono poi a livello del complesso recettoriale GABAA, modulandone l’attività. Il GABA è il neurotrasmettitore inibitorio più importante del sistema nervoso, implicato nella fisiopatogenesi dell'ansia. Numerosi studi hanno evidenziato alterazioni dei livelli di steroidi nei disturbi d’ansia.
Alla luce di queste conoscenze, ligandi selettivi per il TSPO e capaci di modulare la produzione di steroidi possono costituire una nuova classe di composti ansiolitici, capaci di ripristinare i normali livelli steroidei.
Sulla base del modello farmacoforico attualmente conosciuto, sono stati sviluppati nuovi ligandi appartenenti a diverse classi di composti. In particolare, nel presente lavoro di tesi sono stati valutati dal punto di vista biologico 52 nuovi ligandi appartenenti alle classi:
- Pirazolo[1,5-α]pirimidin-acetamidi (1-16).
- 1-fenil-chinazoline (17-52).

L’affinità per il TSPO dei composti di nuova sintesi è stata valutata tramite studi di binding radioattivo all’equilibrio, effettuati su membrane di rene di ratto (tessuto particolarmente ricco di tale proteina), utilizzando come agente competitore il PK11195 triziato, ligando classico del TSPO con affinità nel range nanomolare.



Il radiobinding ha permesso di valutare la concentrazione di ligando di nuova sintesi che inibisce per il 50% il binding del [3H]PK 11195 (IC50). Mediante l’applicazione dell’equazione di Cheng-Prusoff, è stata poi calcolata la costante di affinità (Ki) per ciascun composto.
In seguito, i composti risultati più affini sono stati valutati per la loro capacità di stimolare la produzione di pregnenolone in cellule C6 di glioma di ratto. In breve, le cellule sono state incubate in uno specifico mezzo salino, privo di siero ed addizionato con inibitori del metabolismo del pregnenolone (Trilostano e SU 10603), e trattate per due ore con ligandi classici e di nuova sintesi al TSPO. Al termine dell’incubazione la quantità di pregnenolone rilasciata dalle cellule nel mezzo è stata quantificata con un metodo immunoenzimatico, misurando l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 450 nm.
I risultati ottenuti hanno mostrato una buona affinità di legame per la maggior parte dei composti in esame, con Ki comprese tra 1 e 40 nanomolare.
Per quanto riguarda la produzione di pregnenolone, i composti 12, 13, 31 e 38 hanno mostrato buone capacità di stimolare la produzione dello steroide, con percentuali di incremento rispetto al controllo (contenete il solo solvente DMSO) comprese tra 30 e 40%.
L’insieme di tali risultati rende questi ligandi dei buoni candidati per lo sviluppo di nuove classi di composti a potenziale azione ansiolitica. L’impiego di ligandi al TSPO, capaci di modulare la steroidogenesi, potrebbe, infatti, ripristinare la corretta trasmissione a livello centrale mediata dagli steroidi.




Candidata: Martinelli Lisa Maria

Relatore: Chiarissima Prof.ssa Claudia Martini

SSD: BIO10