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Tesi etd-06242011-160126


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
SETTIMINI, LEONARDO
URN
etd-06242011-160126
Title
L’importanza di PTEN-induced kinase I (PINK-1) nella modulazione dell’autofagia in cellule dopaminergiche
Settore scientifico disciplinare
BIO/13
Corso di studi
MORFOLOGIA E FUNZIONE NORMALE E PATOLOGICA DI CELLULE E TESSUTI
Commissione
tutor Lenzi, Paola
commissario Dott.ssa Frenzilli, Giada
commissario Prof. Regoli, Francesco
commissario Prof.ssa Saccucci, Franca
Parole chiave
  • metanfetamina
  • methamphetamine
  • mitofagia
  • mitophagy
  • PINK1
  • PINK1
  • dopaminergic cells
  • cellule dopaminergiche
Data inizio appello
05/07/2011;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
La macroautofagia è un processo dinamico usato per sequestrare e degradare interi organelli o proteine mal ripiegate tramite una struttura vescicolare a doppio strato di membrana, conosciuta con il nome di autofagosoma, che, unendosi con il lisosoma favorisce la degradazione del substrato. <br>Negli ultimi anni, è emerso per l’autofagia un ruolo sempre più importante nella neuroprotezione. Infatti, la soppressione dell’autofagia conduce a morte cellulare sia in vivo che in vitro, mentre induttori dell’autofagia rimuovono gli aggregati proteici e riducono la morte cellulare apoptotica. Recentemente è stato appurato come la PTEN-induced kinase I (PINK1) risulta essere mutata in forme genetiche di malattia di Parkinson. Comunque i meccanismi che collegano PINK1 alla morte di cellule dopaminergiche (DA) rimangono sconosciuti. Isoforme distinte di PINK1 hanno evidenziato essere attive sia all’esterno che all’interno dei mitocondri. PINK1 interagisce con la proteina pro-autofagica Beclin1 e con la proteina parkina.<br>Lo scopo del presente studio è stato di analizzare in un sistema in vitro la modulazione genetica di PINK1 in condizioni basali e dopo trattamento con metanfetamina (MA) per valutare:<br>1. come la modulazione genetica di PINK1 influenzi i mitocondri <br>2. il coinvolgimento di PINK1 nella modulazione dell’autofagia, ed in particolar modo della “clearence” mitocondriale (mitofagia); <br>3. la presenza nella modulazione del processo autofagico/mitofagico, di un reclutamento da parte di PINK1 del marker generale autofagico LC3, della proteina pro-autofagica Beclin1, della proteina parkina e dell’ubiquitina;<br>4. la variazione nella sopravvivenza cellulare a seguito degli effetti correlati a PINK1.<br>A tal proposito abbiamo usato 5 gruppi sperimentali di colture cellulari dopaminergiche PC12: pcDNA (vettore vuoto, controllo per PINK1wt e PINK1W437X), shSCR (vettore vuoto, controllo per shPINK1), PINK1wt, la forma mutata PINK1W437X e shPINK1 (silenziato). Queste cellule sono state studiate sia in condizioni basali sia a seguito di esposizione con MA, una neurotossina dopaminergica che induce una potente risposta autofagica compensatoria. <br>In condizioni basali il gruppo PINK1wt evidenzia un aumento del numero di mitocondri totali per cellula, mentre mantiene una percentuale di mitocondri alterati uguale al gruppo pcDNA; i gruppi PINK1W437X e shPINK1 evidenziano al contrario un aumento della percentuale di mitocondri alterati. A seguito della somministrazione di MA il gruppo PINK1wt mantiene un aumentato numero di mitocondri totali mentre diminuisce rispetto al gruppo pcDNA la percentuale dei mitocondri alterati; l’aumentata percentuale di mitocondri alterati viene mantenuta nel gruppo PINK1W437X, ed implementata nel gruppo shPINK1. In condizioni basali si assiste nel gruppo PINK1wt all’aumento sia della percentuale di mitocondri positivi alla proteina pro-autofagica Beclin1 che del numero di particelle anti-Beclin1 presenti a livello mitocondriale, al contrario di quanto accade per PINK1W437X e shPINK1 che evidenziano una riduzione. A seguito della somministrazione di MA viene mantenuto l’andamento riscontrato nelle condizioni basali. L’analisi della percentuale di mitocondri positivi alla parkina e alla co-localizzazione Beclin1-parkina evidenzia nei gruppi PINK1W437X e shPINK1 una diminuzione, sia in condizioni basali che a seguito di somministrazione della MA, mentre nel gruppo PINK1wt si assiste ad un aumento nella percentuale di mitocondri positivi alla co-localizzazione Beclin1/parkina a seguito di somministrazione di MA. Il gruppo PINK1wt mostra un aumento del numero di cluster dell’ubiquitina a livello mitocondriale sia in condizioni basali che a seguito della somministrazione della MA; il gruppo PINK1W437X evidenzia un aumento dei cluster dell’ubiquitina in condizioni basali cui si contrappone una diminuzione a seguito della somministrazione della MA; nel gruppo shPINK1 si riscontra invece una diminuzione in condizioni basali che viene implementata a seguito della somministrazione di MA. In condizioni basali non sono riscontrati cambiamenti tra i vari gruppi di trattamento, sia nel numero di vacuoli di tipo autofagico presenti a livello cellulare, sia nel numero di molecole del marker autofagico LC3 presenti a livello di strutture endomembranose e dei vacuoli di tipo autofagico, diversamente da quanto accade a seguito della somministrazione di MA in cui nei gruppi PINK1W437X e shPINK1 si assiste ad una diminuzione rispetto ai gruppi di controllo. Infine mentre in condizioni basali la percentuale di cellule apoptotiche rimane pressoché inalterata tra i vari gruppi di trattamento, a seguito della somministrazione di MA tale percentuale risulta diminuita per il gruppo PINK1wt ed aumentata sia nel gruppo PINK1W437X che, in modo più eclatante, nel gruppo shPINK1. <br>
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