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Tesi etd-06192011-190957


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
FLORIO, NADIA
URN
etd-06192011-190957
Title
VALUTAZIONE DELLA PROPRIETA' DI LEGAME DI UNA VARIANTE DEL RECETTORE UMANO PER L'AMARO TAS2R16.
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE FISIOPATOLOGICHE GENERALI
Commissione
relatore Prof. Dal Monte, Massimo
Parole chiave
  • Nessuna parola chiave trovata
Data inizio appello
21/07/2011;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
21/07/2051
Riassunto analitico
La percezione gustativa è la modalità chemiosensoriale preposta al riconoscimento di stimoli chimici idrosolubili presenti nei cibi. Nonostante il numero e la varietà strutturale delle molecole che possono essere riconosciute, l’uomo può discriminare soltanto tra cinque modalità base del gusto: il dolce, l’amaro, il salato, l’acido e l’umami.<br>Nell’uomo la percezione gustativa serve in primo luogo a controllare l’ingestione volontaria di sostanze. Il suo potere discriminatorio consente di valutare la qualità del cibo, il valore nutrizionale di alcuni composti o la nocività di altri. La percezione dei sapori dolci, ad esempio, permette il riconoscimento di fonti di cibo ad alto contenuto calorico. La capacità di percepire come salati alcuni cationi monovalenti, specialmente il Na+, si è probabilmente evoluta per garantire l’omeostasi ionica ed idrica.<br>Tra le cinque modalità gustative riconosciute dall’uomo, il gusto amaro svolge un importante ruolo di difesa contro l’ingestione di composti potenzialmente tossici, che vengono generalmente riconosciuti come amari. A differenza del gusto dolce e umami, che si sono evoluti per riconoscere un limitato numero di nutrienti, il gusto amaro è in grado di riconoscere un gran numero di composti chimici strutturalmente molto diversi. Nonostante la vastità di questo repertorio, tutti questi composti evocano un&#39;unica sensazione simile che noi percepiamo semplicemente come “amaro“. Questa osservazione ha suggerito che i recettori del gusto amaro si siano evoluti per permetterci il riconoscimento di un vasto assortimento di sostanze, ma non necessariamente per distinguerle tra loro.<br>La percezione del gusto amaro, nell&#39;uomo, è mediata da recettori codificati da 25 geni appartenenti alla famiglia di geni TAS2R.<br>Le sequenze geniche mostrano un&#39;omologia dal 30 al 70% dimostrando una stretta correlazione evolutiva. In particolare, questi geni presentano sequenze altamente conservate nei domini transmembrana e intracellulari, mentre le parti più divergenti si trovano nelle regioni extracellulari che sono quelle potenzialmente in grado di legare le sostanze amare. Negli ultimi anni la ricerca nel campo del gusto è progredita rapidamente e recettori del gusto amaro sono stati evidenziati non solo negli organi implicati alla percezione del gusto, come la lingua, ma anche in altri organi come quelli del tratto gastro-intestinale, il polmone e i tubuli seminiferi. Una cosa estremamente interessante è che alti livelli di variazioni alleliche sono state trovate all&#39;interno dei loci TAS2R. Questa variabilità potrebbe essere alla base della grande diversità nella percezione di composti amari riscontrata nell&#39;uomo.<br>Recentemente, in una popolazione di centenari del sud Italia, è stato osservato che alcuni aplotipi del recettore per l’amaro TAS2R16 correlano con l’età dei soggetti, e che la loro frequenza aumenta con l’aumentare dell’età. L’analisi statistica, perciò, indica che la presenza di particolari aplotipi del recettore TAS2R16 rappresenta, almeno in questa popolazione, una sorta di fattore di protezione che consente di vivere fino ad età molto avanzata. Poiché le diverse varianti di uno stesso recettore possono legare in maniera diversa lo stesso ligando, portando così ad una percezione differenziale del sapore amaro di determinate sostanze, ci siamo chiesti se i diversi aplotipi del recettore TAS2R16 possano legare con diversa affinità i ligandi di questo recettore, evidenziando così una differenza funzionale prodotta dalle diverse varianti genetiche. In particolare, in questa tesi è stata analizzata la capacità legante di uno degli aplotipi suddetti, quello in cui un polimorfismo a singolo nucleotide porta alla sostituzione dell’amminoacido 222 del recettore TAS2R16, una arginina, con una istidina. La capacità di legame di questo aplotipo nei confronti di un ligando per il recettore TAS2R16, la salicina, è stata messa a confronto con quella dell’aplotipo “wild type” del recettore. Da campioni di saliva di diversi individui sono stati isolati i DNA genomici, da cui sono stati identificati mediante PCR e sequenziamento dei prodotti ottenuti le varianti del recettore TAS2R16 di interesse. Il DNA è stato inserito in un opportuno plasmide con il quale sono stati transfettati ceppi di E. Coli competenti in modo da amplificare il recettore ed ottenerne le opportune quantità con cui procedere a saggi di binding in vitro, utilizzando cellule HEK293 transfettate stabilmente con una forma chimerica della proteina G specifica delle cellule gustative, la gustducina. Le cellule sono state transfettate con le diverse forme del recettore TAS2R16 e trattate con un colorante sensibile al calcio, il Fluo4-AM. Le cellule che esprimono il recettore umano, in risposta alla salicina, attivano una via di trasduzione che comporta l’ingresso di calcio nella cellula, calcio che , legandosi al colorante, determina l’emissione di fluorescenza rilevata con un fluorimetro.
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