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Tesi etd-05202015-121228


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
PAGNOTTA, FIORENZA
URN
etd-05202015-121228
Title
ESTRAZIONE, PURIFICAZIONE E VALUTAZIONE DELL’ATTIVITA’ ANTITUMORALE DELL’OLEOCANTALE SU LINEE CELLULARI UMANE
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Prof. Manera, Clementina
relatore Prof.ssa Nieri, Paola
Parole chiave
  • oleocantale
  • estrazione
  • A375
  • Caco2
  • Colo320
  • antitumorale
Data inizio appello
10/06/2015;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
L’olio vergine d’oliva, principale componente della dieta mediterranea, ha dimostrato avere effetti benefici sulla salute umana, in particolare nella prevenzione di malattie cardiovascolari, neurodegenerative, infettive ed anche tumorali. Tra i numerosi costituenti dell’olio d’oliva, i derivati secoiridoidi e, in particolare, l’oleocantale, hanno dimostrato avere un ruolo importante, sia per la loro azione antiossidante che per altri meccanismi mediati da un target cellulare specifico.<br>L’oleocantale è responsabile della sensazione di pizzicore e bruciore a livello orofaringeo che può provocare l’olio stesso introdotto con la dieta. Questa molecola ha effetti simili al noto FANS ibuprofene, con cui condivide, non solo l’azione leggermente irritante a livello orofaringeo, dovuta all’interazione con il recettore TRPA1, ma anche la ancor più nota azione inibitoria nei confronti delle ciclossigenasi COX-1 e COX-2. L’attività sulle COX può giustificare il potenziale ruolo benefico dell’oleocantale in diverse malattie croniche. Tuttavia, altri meccanismi di azione sono stati proposti in base a evidenze derivanti da studi recenti su questa molecola. Il presente lavoro di tesi è consistito nella messa a punto di una procedura di estrazione e purificazione dell’oleocantale dall’olio vergine di oliva e nella valutazione della attività antiproliferativa specifica su alcune linee tumorali di melanoma umano e adenocarcinoma del colon. Per quanto riguarda l’estrazione e la purificazione dell’oleocantale, è stata utilizzata una procedura già riportata in letteratura, ma con alcune modifiche al fine di migliorarne la resa. Questa procedura prevede l’iniziale estrazione della matrice oleosa con n-esano e acetonitrile mediante l’uso di centrifuga. La fase acetonitrilica, dopo evaporazione, ha fornito un residuo che è stato sottoposto a flash-cromatografia su gel di silice, usando come fase mobile una miscela di etere di petrolio-acetato di etile secondo gradiente di eluizione; infine, le frazioni, contenenti il composto fenolico desiderato, sono state riunite ed ulteriormente purificate mediante TLC preparativa, utilizzando una miscela di etere di petrolio/acetato di etile 4:6 come eluente. Ciò ha permesso di ottenere l’oleocantale con una purezza maggiore del 95%. In seguito, è stata testata l’ efficacia dell’oleocantale puro sulla linea cellulare di melanoma umano A-375, sulle cellule di carcinoma intestinale Colo-320 e Caco-2. L’oleocantale è stato saggiato in un range di concentrazioni di 0.1-100 µM, diluito in DMSO. Le linee cellulari sono state mantenute in coltura ad una temperatura di 37°C e con un contenuto di CO2 del 5%, utilizzando come terreni di coltura DMEM, per le Caco-2, e RPMI per le altre linee cellulari; entrambi i mezzi erano ricostituiti con il 10% di FBS e l’1% di una miscela di antibiotici di streptomicina/penicillina 1:1. La vitalità cellulare è stata saggiata, dopo 72 ore dal trattamento con l’oleocantale, attraverso saggio colorimetrico (WST-1). Ogni esperimento è stato condotto in triplicato. In seguito al trattamento, è stato riscontrato che l’oleocantale è capace di ridurre la vitalità delle cellule umane di melanoma e carcinoma al colon, in modo dose-dipendente, con IC50 di 21.0±1.2 µM per le A-375, 30.12±1.3 µM per le Colo-320, e 79.28±1.2 µM per le Caco-2; n=3 per ogni esperimento. Avendo riscontrato il maggior effetto sulle cellule di melanoma, sono stati svolti esperimenti anche su fibroblasti umani cutanei (HDFa), come controllo non tumorale: in queste cellule non è stata riscontrata alcuna citotossicità se non per concentrazioni di oleocantale elevate. Anche per le HDFa è stato utilizzato come terreno di coltura l’RPMI ricostituito con il 10% di FBS e l’1% di una miscela di antibiotici di streptomicina/penicillina 1:1.<br>La sperimentazione realizzata nel presente lavoro di tesi rileva, dunque, un effetto antitumorale in vitro su cellule di melanoma cutaneo verso il quale non ci sono ad oggi dati della letteratura e conferma, invece, effetti su linee tumorali di adenocarcinoma di colon, con valori di IC50 in accordo con la letteratura. L’azione sul melanoma appare interessante per la specificità mostrata dal confronto con cellule dermiche non tumorali. Gli esperimenti futuri saranno rivolti a confermare su altre linee di melanoma cutaneo o su altri tumori della pelle questa azione dell’oleocantale, investigandone anche il meccanimso d’azione.
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