ETD system

Electronic theses and dissertations repository

 

Tesi etd-05142010-140105


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
PICCININI, ELISA
URN
etd-05142010-140105
Title
Post translational modifications in the GDNF molecule: functional characterization
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
NEUROBIOLOGIA
Supervisors
relatore Prof. Saarma, Mart
relatore Dott.ssa Garcia Gil, Maria De Las Mercedes
correlatore Prof.ssa Camici, Marcella
correlatore Dott. Caleo, Matteo
Parole chiave
  • Parkinson
  • GDNF
  • glicosilazione
  • glycosylation
  • furina
  • furin
Data inizio appello
19/07/2010;
Consultabilità
Parziale
Data di rilascio
19/07/2050
Riassunto analitico
La malattia di Parkinson è caratterizzata dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici. Il GDNF (Glial cell line Derived Neurotrophic Factor) è stato scoperto inizialmente per le sue proprietà neurotrofiche su neuroni dopaminergici e, nonostante le sue funzioni anche esterne al sistema nervoso centrale, l’interesse clinico si è concentrato sul suo potenziale nel trattamento della mallatia di Parkinson. È stato dimostrato che il GDNF ha effetti protettivi e neurorestorativi in diversi modelli animali di Parkinson e questa molecola ha inoltre mostrati risultati promettenti in due trial clinici su tre.
Il GDNF appartiene alla famiglia dei GFL (GDNF Family Ligands). Gli altri membri della famiglia sono neurturina, artemina e persefina. In presenza dei corecettori GFRα1-4 (GDNF Family Receptor), i GFL possono attivare il recettore tirosin chinasico RET (Rearranged during Transfection). Il GDNF segnala preferenzialmente attraverso il corecettore GFRα1.
A causa dell’interesse terapeutico, gran parte della ricerca si è focalizzata su come viene formato il complesso recettoriale, dove sono espresse le varie componenti e quali cascate intracellulari vengono attivate da RET. Al contrario, si sa molto poco su come il GDNF è sintetizzato, trasportato e degradato. Il GDNF è sintetizzato come una preproproteina, ed è stato determinato l’N-terminale della proteina matura, che viene secreta. La molecola è anche stata cristallizzata: è dimerica, con sette ponti cisteinici. È anche ben documentato che il GDNF è N-glicosilato, ma i dettagli e il ruolo di questa glicosilazione non sono stati studiati.
In questo lavoro ho eseguito un’analisi computazionale delle potenziali modifice post traduzionali nel GDNF in diverse specie, e ho anche comparato i quattro membri della famiglia dei GFL. I due potenziali siti di N-glicosilazione sono conservati nei mammiferi, negli uccelli, in Xenopus e nei pesci. Il primo sito di N-glicosilazione si sul primo “dito” della molecola, vicino a residui coinvolti nel legame al recettore, e perciò potrebbe essere coinvolto nella specificità della molecola per il GFRα1. Il secondo sito si trova vicino al “polso”, fra le due “dita”. È interessante notare come tutti i GFL (tranne la persefina che è il membro più divergente della famiglia) abbiano un potenziale sito di taglio da parte della furina nella stessa regione.
Ho preparato mutanti a cui mancava il primo sito di glicosilazione o sia il primo che il secondo sito, mentre varianti con la mutazione del solo secondo sito, del sito di taglio della furina o di entrambi questi due ultimi siti erano già stati sintetizzati.
Ho analizzato le diverse varianti dopo averle fatte esprimere in cellule CHO, usando western blot con anticorpi anti-GDNF. L’analisi dell’espressione del GDN in presenza o assenza di tunicamicina rivela che solo il primo dei due potenziali siti di N-glicosilazione è in uso. Comunque saggi di fosforilazione di RET mostrano che questo sito non cambia la specificità del GDNF nei confronti dei diversi GFRα: la glicosilazione su questo sito sembra influire maggiormente sul processamento della proteina, che è apparentemente secreta come proGDNF e in quantità minore (mentre l’ammontare di proteina intracellulare è comparabile con quello del GDNF wild type). In realtà, in questo caso il livello di fosforilazione di RET è più basso di quello indotto dal wild type, ma questo non è causato dalla mancanza di glicosilazione. Ho anche prodotto infatti un mutante sul primo sito di glicosilazione che manca della sequenza pro: in questo caso la fosforilazione di RET era allo stesso livello di quella indotta dal wild type, nonostante l’ammontare di questa variante di GDNF nel medium fosse ancora minore rispetto a quella del mutante sul primo sito di N-glicosilazione con la sequenza pro.
È difficile dire quanto la mancanza di glicosilazione influenzi la stabilità di questi mutanti, a causa del fatto le la loro quantità nel medium è minore rispetto a quella del wild type, ma è comunque possibile vedere che questi mutanti sono più stabili rispetto al GDNF ricombinante prodotto in E. coli, che manca sia di glicosilazione che di sequenza pro, che è stato usato nei trials clinici.
Il sito di taglio da parte della furina si trova immediatamente dopo l’α-elica e secondo le analisi computazionali è conservato nei mammiferi, uccelli e nello Xenopus. Comunque questo sito sembra non essere in uso durante la secrezione della molecola, poiché quando il GDNF è coespresso in cellule CHO insieme alla furina (sia full-lenght che solubile), solo le bande che si pensa corrispondano al proGDNF (glicosilato e non); inoltre non si osservano differenze fra il GDNF wild type e il mutante sul sito previsto di taglio della furina. Gli stessi risultati sono stati ottenuti quando il GDNF è stato digerito con furina commerciale.
Il sito sembra non essere in uso anche quando il GDNF si lega al complesso recettoriale, infatti sia la durata che i livelli di fosforilazione indotti dal mutante sul sito furinico sono gli stessi di quelli indotti dal wild type.
-
Parkinson’s disease is characterised by a degeneration of dopaminergic neurons. The glial-cell-line-derived neurotrophic factor (GDNF) was first discovered as a neurotrophic factor for dopaminergic neurons and, in spite of its functions also outside the central nervous system, the clinical interest in this protein has focused on the potential of GDNF in the treatment of Parkinson’s disease. GDNF has been shown to have protective and neurorestorative effects in several animal models of the Parkinson’s disease, and GDNF has also showed promising results in two out of three clinical trials.
GDNF belongs to the GDNF family ligands (GFLs). The other members of this family are the highly homologous neurturin, artemin and persephin. In the presence of the co-receptors GDNF family receptors α 1-4 (GFRα1-4) the GFLs can activate the receptor tyrosine kinase RET (REarranged during Transfection). GDNF signals preferentially through GFRα1.
Due to the clear clinical interest in GDNF, a lot of research has focused on how the receptor complex is formed, where the ligand-receptor components are expressed, and what intracellular signalling cascades as well as biological functions RET mediates. On the contrary, very little is known on how GDNF is synthesised, transported and degraded. GDNF is synthesised as a preproprotein, and the N-terminus of the secreted mature protein has been determined. The crystal structure of GDNF shows that the protein is dimeric, with seven cystein bridges. It is also well documented that GDNF is N-linked glycosylated, but the details and role of this glycosylation has not been studied.
In this study I have made a computational mapping of the potential post-translational modifications in GDNF from different species. I have also compared the four human GFLs. I have found that the two potential N-linked glycosylation sites in GDNF are conserved in mammalian, birds and frog. The first of the glycosylation sites is located close to the receptor-binding finger tip, and may therefore be involved in restricting the specificity of GDNF to GFRα1. The second glycosylation site is located adjacent to the “hinge” region, between the two receptor-binding “finger structures”. Interestingly all the human GFLs (except persephin, which is however the most divergent member of the family) harbour a potential furin cleavage site in the same hinge region.
I prepared GDNF mutants which lack the first predicted glycosylation site or both the first and the second sites, while variants lacking the second glycosylation site, the furin cleavage site, or both the second glycosylation site and the furin site had already been synthesized.
I have analyzed the variants after expression in CHO cells, using Western blotting with anti-GDNF antibodies. Expression analysis in the presence or absence of tunicamycin shows that only one of the two potential glycosylation sites is in use. This site is close to the receptor binding finger tip. However, the results from RET phosphorylation assays show that this glycosylation site does not change the specificity of GDNF with regard to the different GFRα receptors: glycosylation on the first site seems to affect mainly the processing of the protein which is apparently secreted in its proform and in a lower amount (while its quantity inside the cell is comparable to the one of wild type GDNF). In this case, actually, the phosphorylation level of RET is lower than the one obtained with wild type, but this is not caused by lack of glycosylation or amount of GDNF in the medium: when a mutant on the first glycosylation site lacking the prosequence was created, levels of RET phosphorylation were the same as the ones induced by wild type, despite the amount of this GDNF variant in the medium being even lower than the amount of the mutant on the first glycosylation site.
It is difficult to tell how much the stability of these mutants is affected by the lack of glycosylation, since their amount in the medium is much lower than the amount of wild type, but still it is possible to see that these variants are still more stable than recombinant GDNF produced in E. coli which lacks both glycosylation and prosequence and that has been used in clinical trials.
The putative furin cleavage site is located immediately after the α-helix and according to computational analysis it is conserved in mammals, birds and X. laevis. However this site seems not to be in use during secretion, since when wild type GDNF was coexpressed with either full-length or soluble furin only the bands that are thought to correspond to proGDNF (either glycosylated or not) were affected; moreover no differences were observed between wild type GDNF and a variant with mutation of the putative furin cleavage site. The same results were obtained when digestion with commercial furin was performed.
The furin site in not in use even when GDNF binds to the GFRα-RET complex, since both the duration and the amount of phosphorylation induced by this mutant are the same as the ones induced by wild type.
File