Thesis etd-05082019-214123 |
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Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
MAZZA, CRISTINA
URN
etd-05082019-214123
Thesis title
Effetti del silenziamento sia parziale che totale della 5'-nucleotidasi citosolica (cN-II) in un modello di adenocarcinoma mammario MDA-MB231.
Department
BIOLOGIA
Course of study
BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE
Supervisors
relatore Prof.ssa Tozzi, Maria Grazia
relatore Dott.ssa Pesi, Rossana
relatore Dott.ssa Pesi, Rossana
Keywords
- 5' -nucleotidasi citosolica
- adenocarcinoma mammario
- metabolismo
- nucleotidi
Graduation session start date
27/05/2019
Availability
Withheld
Release date
27/05/2089
Summary
La 5’-nucleotidasi II (cN-II) è un enzima citosolico facente parte di una famiglia di fosfatasi i cui
componenti differiscono per ubicazione nel contesto cellulare, specificità di substrato e tipo di
regolazione. I suoi migliori substrati sono IMP, GMP ed i loro deossiderivati; è attivato da ATP, ADP
e 2-bisfosfoglicerato ed è inibito da concentrazioni fisiologiche di fosfato. La cN-II citosolica, grazie alla sua attività fosfatasica, contribuisce al mantenimento del pool di nucleotidi intracellulari, in particolare dei composti purinici come l’inosina monofosfato (IMP); infatti quando il livello energetico cellulare è alto, l’enzima promuove il catabolismo dell’IMP in eccesso che è poi
eventualmente convertito in acido urico, mentre quando lo stato energetico della cellula è basso
permette l’accumulo dell’IMP, del GMP e dell’adenosina monofosfato (AMP).
Un’intensa attività della cN-II è stata osservata in cellule e tessuti neoplastici e molti studiosi hanno osservato che la cN-II è anche coinvolta nella resistenza ai farmaci utilizzati nella chemioterapia antitumorale basata sull’uso di analoghi dei nucleosidi, anche quando i farmaci non sono substrato dell’enzima, indicando quindi che la cN-II potrebbe essere un marker prognostico generale di
sopravvivenza. Al fine di comprendere il ruolo fisiologico dell’enzima, molti gruppi di ricerca hanno
avviato studi su diversi modelli cellulari tumorali in cui la cN-II è stata silenziata o sovra-espressa.
Questo approccio è stato applicato, per esempio, su una linea cellulare di astrocitoma umano (ADF)
in cui il silenziamento della cN-II è stato visto essere associato ad una diminuzione della
proliferazione cellulare mentre la sua sovra-espressione ad un incremento della crescita cellulare.
Su una linea tumorale polmonare (A549) il silenziamento della cN-II era accompagnato da una
ridotta proliferazione cellulare rispetto ai controlli, da uno spostamento metabolico da glicolitico a
ossidativo e da maggiori difese antiossidanti.
Alla luce delle osservazioni fatte sui modelli tumorali sopracitati è nata l’idea di valutare il ruolo
dell’enzima nella proliferazione e nella regolazione metabolica anche in cellule di adenocarcinoma
mammario, in particolare nella linea MDA-MB231. Tutte le analisi sono state condotte sulla
sopracitata linea cellulare tumorale in cui era stata già precedentemente inibita la cN-II secondo due
diverse metodiche molecolari: la tecnica CRISPR-Cas9 che ha generato il silenziamento totale
dell’enzima e l’utilizzo di un plasmide contenente una short hairpin (attuando quindi un tipo di
repressione post-trascrizionale) da cui è conseguito un silenziamento costitutivo dell’enzima di circa
il 50%.
Su questi modelli cellulari ed i relativi controlli sono state eseguite numerose analisi: la curva di
crescita, la determinazione della espressione ed attivazione, mediante western blot, delle chinasi
AKT, AMPK, e delle proteine regolatorie p53 ed il suo bersaglio p21. Sono stati anche effettuati
dosaggi dell’attività enzimatica di altri rilevanti indicatori metabolici come l’esochinasi e la lattato
deidrogenasi come indici della velocità glicolitica, la citrato sintasi come valutazione dell’attività
mitocondriale, nonché la misura dei tioli ridotti per l’analisi della capacità antiossidante. I risultati ci potranno indicare un meccanismo molecolare che leghi i livelli di espressione della cN-II citosolica e la regolazione della proliferazione e del metabolismo.
componenti differiscono per ubicazione nel contesto cellulare, specificità di substrato e tipo di
regolazione. I suoi migliori substrati sono IMP, GMP ed i loro deossiderivati; è attivato da ATP, ADP
e 2-bisfosfoglicerato ed è inibito da concentrazioni fisiologiche di fosfato. La cN-II citosolica, grazie alla sua attività fosfatasica, contribuisce al mantenimento del pool di nucleotidi intracellulari, in particolare dei composti purinici come l’inosina monofosfato (IMP); infatti quando il livello energetico cellulare è alto, l’enzima promuove il catabolismo dell’IMP in eccesso che è poi
eventualmente convertito in acido urico, mentre quando lo stato energetico della cellula è basso
permette l’accumulo dell’IMP, del GMP e dell’adenosina monofosfato (AMP).
Un’intensa attività della cN-II è stata osservata in cellule e tessuti neoplastici e molti studiosi hanno osservato che la cN-II è anche coinvolta nella resistenza ai farmaci utilizzati nella chemioterapia antitumorale basata sull’uso di analoghi dei nucleosidi, anche quando i farmaci non sono substrato dell’enzima, indicando quindi che la cN-II potrebbe essere un marker prognostico generale di
sopravvivenza. Al fine di comprendere il ruolo fisiologico dell’enzima, molti gruppi di ricerca hanno
avviato studi su diversi modelli cellulari tumorali in cui la cN-II è stata silenziata o sovra-espressa.
Questo approccio è stato applicato, per esempio, su una linea cellulare di astrocitoma umano (ADF)
in cui il silenziamento della cN-II è stato visto essere associato ad una diminuzione della
proliferazione cellulare mentre la sua sovra-espressione ad un incremento della crescita cellulare.
Su una linea tumorale polmonare (A549) il silenziamento della cN-II era accompagnato da una
ridotta proliferazione cellulare rispetto ai controlli, da uno spostamento metabolico da glicolitico a
ossidativo e da maggiori difese antiossidanti.
Alla luce delle osservazioni fatte sui modelli tumorali sopracitati è nata l’idea di valutare il ruolo
dell’enzima nella proliferazione e nella regolazione metabolica anche in cellule di adenocarcinoma
mammario, in particolare nella linea MDA-MB231. Tutte le analisi sono state condotte sulla
sopracitata linea cellulare tumorale in cui era stata già precedentemente inibita la cN-II secondo due
diverse metodiche molecolari: la tecnica CRISPR-Cas9 che ha generato il silenziamento totale
dell’enzima e l’utilizzo di un plasmide contenente una short hairpin (attuando quindi un tipo di
repressione post-trascrizionale) da cui è conseguito un silenziamento costitutivo dell’enzima di circa
il 50%.
Su questi modelli cellulari ed i relativi controlli sono state eseguite numerose analisi: la curva di
crescita, la determinazione della espressione ed attivazione, mediante western blot, delle chinasi
AKT, AMPK, e delle proteine regolatorie p53 ed il suo bersaglio p21. Sono stati anche effettuati
dosaggi dell’attività enzimatica di altri rilevanti indicatori metabolici come l’esochinasi e la lattato
deidrogenasi come indici della velocità glicolitica, la citrato sintasi come valutazione dell’attività
mitocondriale, nonché la misura dei tioli ridotti per l’analisi della capacità antiossidante. I risultati ci potranno indicare un meccanismo molecolare che leghi i livelli di espressione della cN-II citosolica e la regolazione della proliferazione e del metabolismo.
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