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Tesi etd-05052008-155150


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
BIMBI, GIANNI
URN
etd-05052008-155150
Title
Replicazione del genoma del virus adeno-associato in Saccharomyces cerevisiae
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE E TECNOLOGIE BIOMOLECOLARI
Commissione
Relatore Dott.ssa Cervelli, Tiziana
Relatore Prof. Galli, Alvaro
Parole chiave
  • replicazione
  • adeno-associato
  • virus
  • lievito
  • Saccharomyces cerevisiae
  • AAV
Data inizio appello
09/06/2008;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
09/06/2048
Riassunto analitico
I vettori basati sul virus Adeno-Associato (AAV) sono strumenti promettenti per il trasferimento di geni negli studi sulla terapia genica. Due principali limitazioni ostacolano il loro utilizzo: la loro efficienza di trasduzione, che è altamente variabile a seconda dei tipi cellulari e la mancanza di metodi di produzione e di purificazione efficienti. La disponibilità di un sistema eucarotico semplice che permetta la replicazione dell&#39; AAV potrebbe fornire un&#39;eccellente mezzo per lo studio della biologia di questo virus e, soprattutto, per la produzione di vettori virali basati sull&#39; AAV.<br>In questa tesi abbiamo studiato la capacità del lievito Saccharomyces cerevisiae di sostenere la replicazione del virus AAV ricombinante (rAAV).<br>Quando un plasmide contente il genoma di AAV, ricombinante per il gene URA3 di S. cerevisiae è co-trasformato in lievito con un plasmide che esprime Rep68 (una proteina essenziale per la replicazione del DNA dell&#39; AAV), si osserva un elevato numero di colonie URA3+, indicazione che il DNA di AAV si è replicato in questo organismo. Al contrario, la co-espressione di Rep40 (una proteina coinvolta nella maturazione dell&#39;AAV) non ha effetto sul numero di colonie URA3+. Le analisi molecolari effettuate sulle colonie URA3+ hanno indicato che la replicazione del DNA di AAV produce genomi in singola copia ed a singolo filamento. Attraverso Southern Blot abbiamo individuato gli intermedi di replicazione del genoma di AAV.<br>Inoltre abbiamo effettuato esperimenti con ceppi di lievito che portano delezioni nei geni della ricombinazione omologa ed i risultati preliminari indicano che le proteine Rad50 e Rad52 sono coinvolte nella replicazione di AAV.<br>Infine abbiamo costruito un vettore per esprimere le proteine del capside di AAV. I risultati di Western blot dimostrano che il lievito produce la proteina VP3.<br>In conclusione questo lavoro dimostra per la prima volta che il lievito potrebbe essere un organismo utile sia per la preparazione di vettori per la terapia di genica che per studiare la biologia di AAV.<br>
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