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Tesi etd-03282010-112309


Thesis type
Tesi di laurea specialistica
Author
FRANCESCHI, SARA
URN
etd-03282010-112309
Title
La resistenza alla terapia antiaggregante: sviluppo di una metodologia "gel-free" per l'analisi proteomica delle piastrine
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Dott. Citti, Lorenzo
relatore Prof.ssa Nieri, Paola
Parole chiave
  • LC-MALDI-TOF/TOF
  • gel-free
  • Proteomica
  • resistenza
  • Clopidogrel
  • Acido Acetilsalicilico
  • terapia antiaggregante
  • piastrine
  • Sindrome Coronarica Acuta
Data inizio appello
28/04/2010;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Le Malattie Cardiovascolari rappresentano attualmente la principale causa di mortalità e morbilità nei paesi occidentali. In quest&#39;ambito la maggiore incidenza è determinata dalle arteriopatie coronariche, responsabili di una serie di manifestazioni cliniche raggruppate nella denominazione di Sindrome Coronarica Acuta (ACS). Le linee guida europee e americane prevedono, per il trattamento della ACS, una terapia antiaggregante combinata di Acido Acetilsalicilico (ASA) e Clopidogrel. Tuttavia una percentuale che si aggira tra il 10 e il 20% dei pazienti trattati, definiti resistenti, sembra non ricevere alcuna protezione dalla terapia antiaggregante e incorre nuovamente in un evento ischemico.<br>Questo lavoro di Tesi è stato svolto all’interno del laboratorio di “Proteomica e Tecnologie Genomiche” dell’Istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa e fa parte di un progetto strategico della ricerca finalizzata del Ministero della Salute chiamato: “Activity of Platelets after Inhibition and Cardiovascular Events - APICE”. Il progetto APICE si pone come obiettivo quello di valutare con un’indagine proteomica l&#39;espressione di proteine piastriniche nelle diverse fasi cliniche della ACS, in particolare mira a definire i differenti profili proteici tra pazienti che rispondono e che non rispondono alla terapia farmacologica ASA/Clopidogrel.<br>Lo scopo principale di questa Tesi è stato quello di sviluppare una metodologia riproducibile, valida per il trattamento e la manipolazione dei campioni clinici, per la loro analisi strumentale e l’elaborazione finale dei dati, tale che in seguito possa essere adottata come metodo standard di analisi per tutti i campioni del progetto APICE. Questa Tesi sperimentale, perciò, ne rappresenta il punto di partenza.<br>I campioni, forniti dall&#39;Azienda Ospedaliera Universitaria di Careggi, Firenze, contengono il sedimento delle piastrine isolate dal sangue periferico dei diversi pazienti affetti da ACS e reclutati appositamente.<br>La complessità del proteoma e il divario di concentrazione delle proteine piastriniche rendono difficile la rilevazione di quelle espresse a livelli molto bassi, riducendo la sensibilità dell’analisi. Abbiamo perciò cercato di ridurre la complessità del campione utilizzando metodi precedentemente convalidati sul plasma umano, che rappresenta un esempio emblematico di miscela complessa di proteine. Abbandonata una prima ipotesi di eseguire un “cut-off” di peso molecolare, sono state fatte prove di pre-frazionamento applicando un metodo di cromatografia “flash” con diversi tipi di resine ma nessuna di queste tecniche ha prodotto un esito positivo. E’ stato ipotizzato che questo sorprendente risultato negativo fosse dovuto a caratteristiche specifiche delle proteine piastriniche, come per esempio particolari modificazioni post-traduzionali.<br>L’impossibilità di un pre-frazionamento unita alla consapevolezza dell’esistenza delle limitazioni della separazione elettroforetica bidimensionale (2D-GE), specie quando si intenda affrontare l&#39;analisi di un gran numero di campioni complessi (high throughput analysis), ha portato alla scelta obbligata di un’analisi dell’estratto proteico intero e alla ricerca dello sviluppo di una metodica alternativa che non fosse basata sull’applicazione dell’elettroforesi bidimensionale, quindi “gel-free”. La metodologia sperimentale adottata, LC-MALDI-TOF/TOF, può essere schematizzata come segue:<br>• Preparazione dell’estratto grezzo totale e digestione enzimatica con tripsina; <br>• Quantificazione del contenuto peptidico mediante corsa in nano-HPLC;<br>• Separazione mediante cromatografia nano-HPLC in fase inversa dei peptidi, mescolamento con la matrice MALDI e raccolta robotizzata delle frazioni (spot) direttamente sul supporto dello spettrometro di massa;<br>• Analisi di ciascuno spot sia in condizioni di singola massa (MS) che tandem (MS/MS);<br>• Analisi bioinformatica dei dati di spettrometria di massa.<br>Per convalidare sia il sistema di trattamento e di analisi che l’elaborazione finale dei risultati ottenuti dalla spettrometria di massa, sono stati selezionati, tra tutti quelli forniti per questo studio, tre campioni: a fronte di un soggetto sensibile, gli altri due risultano resistenti rispettivamente all’ASA ed al Clopidogrel. Oltre ad ottenere un&#39;ampia lista di proteine identificate, siamo riusciti a riscontrare, con l&#39;utilizzo di un software che esegue un confronto semi-quantitativo, una serie di proteine differenzialmente espresse tra i tre campioni. Queste diversità, avendo preso in considerazione solo pochi campioni, non hanno un valore diagnostico generale in relazione al tipo di resistenza al trattamento farmacologico. Tuttavia hanno permesso di sottolineare interessanti osservazioni. Molte delle proteine differenzialmente espresse, infatti, sono coinvolte direttamente nell’adesione, nell’attivazione e nell’aggregazione piastrinica. Inoltre, la diversità nei livelli con cui le proteine sono più o meno espresse nei due tipi di resistenza confermerebbe la diversità dei meccanismi di resistenza all’azione di ASA e Clopidogrel.
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