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Tesi etd-03212019-135613


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
VALDISERRA, GIULIA
URN
etd-03212019-135613
Title
Ruolo della glia enterica nella fisiopatologia dei disturbi motori intestinali in un modello di obesità indotto da dieta ipercalorica
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Dott. Fornai, Matteo
correlatore Dott.ssa Testai, Lara
Parole chiave
  • HFD
  • glia enterica
  • obesità
  • dieta ipercalorica
  • motilità intestinale
Data inizio appello
10/04/2019;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
10/04/2022
Riassunto analitico
L’obesità è una patologia multifattoriale, la quale, oltre ad essere caratterizzata da alterazioni della motilità intestinale, è associata ad insulino resistenza, incremento dello stress ossidativo, aumento dell’espressione dei markers di infiammazione e a un’aumentata permeabilità dell’epitelio intestinale. L’aumento della permeabilità intestinale comporta infatti un incremento del passaggio di batteri e altri antigeni presenti nel lume intestinale (es. lipopolisaccaride, LPS) attraverso la mucosa innescando così l’attivazione di processi immuno/infiammatori che determinano un notevole rimodellamento morfo-funzionale del compartimento neuromuscolare enterico, contribuendo alla genesi dei disturbi gastrointestinali. Studi recenti hanno dimostrato che le cellule gliali enteriche (EGCs), parte integrante del sistema nervoso enterico (SNE), svolgono un ruolo fondamentale nel regolare sia la permeabilità della barriera epiteliale che la motilità intestinale. Alterazioni della glia enterica possono determinare quindi risposte infiammatorie e alterazioni della permeabilità epiteliale che possono contribuire alla patogenesi della dismotilità intestinale associata all’obesità e alla diffusione del processo immuno-infiammatorio ad altri organi e apparati.
Scopo dello studio: chiarire il ruolo della glia enterica nei processi immuno-infiammatori che conducono a una alterata permeabilità epiteliale con conseguente dismotilità intestinale e valutare l’eventuale coinvolgimento della glia nella regolazione delle funzioni neuromotorie enteriche di natura tachichininergica.
Metodi
In vivo: Topi maschi CB57BL/6 sono stati alimentati con una dieta ad alto contenuto di grassi (60% delle calorie derivanti da lipidi - high fat diet, HFD) per 8 settimane per riprodurre una situazione tipica dell’obesità. Animali di controllo sono stati alimentati con un dieta normocalorica (18% delle calorie derivanti da lipidi - standard diet, SD). Durante il periodo di trattamento, il peso corporeo è stato misurato settimanalmente. Al termine delle 8 settimane, gli animali sono stati sacrificati e i seguenti parametri sono stati esaminati: peso del grasso epididimale, livelli ematici di colesterolo, trigliceridi e glucosio. Il colon è stato isolato e utilizzato per l’allestimento di preparati di muscolatura liscia longitudinale, sui quali sono stati condotti studi funzionali mirati alla valutazione dell’attività contrattile tachichininergica neurogena e miogena. Inoltre, al fine di valutare la risposta infiammatoria enterica conseguente a una dieta HFD sono stati valuti i livelli di interleuchina (IL)-1β e IL-6 su campioni di colon isolati dai vari gruppi di trattamento. Su gli stessi campioni è stata valutata l’espressione della proteina tight junction occludina, al fine di corroborare l’ipotesi relativa ad un’aumentata permeabilità intestinale conseguente a un regime dietetico iperlipidico.
Colture cellulari: la linea cellulare di glia enterica di ratto (EGC) è stata coltivata in opportuni mezzi di coltura. Le cellule gliali sono state trattate per 4 giorni con palmitato per mimare le condizioni di una dieta HFD e/o con lipopolisaccaride (LPS) nelle ultime 24 ore dell’esperimento. LPS è un componente della parete dei batteri gram negativi che può entrare in contatto con le cellule immunitarie della mucosa intestinale, in seguito a un aumento della permeabilità epiteliale intestinale. Al termine dell’esperimento le cellule sono state lisate per valutare i livelli di espressione di: recettori toll-like-4 (TLR-4), recettore responsabile del riconoscimento di LPS da parte delle cellule gliali; fosforilazione di JNK, fattore di trascrizione coinvolto nell’attivazione della trascrizione di geni codificanti per citochine infiammatorie. Per valutare il rilascio di IL-1β e sostanza P nei sovranatanti cellulari da parte dalle cellule gliali, sono stati utilizzati kit immunoenzimatici.
Risultati
I topi alimentati con HFD mostravano un aumento significativo del grasso epididimale, del peso corporeo e dei livelli plasmatici di glucosio, trigliceridi e colesterolo rispetto agli animali trattati con SD. Studi funzionali condotti su preparati di colon isolati da topi HFD mostravano un aumento significativo delle risposte tachichininergiche neurogene rispetto a topi SD, mentre le contrazioni miogene indotte da sostanza P esogena non risultavano modificate in maniera significativa. Inoltre, i tessuti colici prelevati da topi HFD e incubati con fluorocitrato (inibitore selettivo della glia enterica) all’interno dei bagni per organi isolati, hanno evidenziato una diminuzione delle contrazioni tachichininergiche neurogene, le quali risultavano simili a quelle osservate nei tessuti colici SD, suggerendo che la glia può rappresentare una fonte di sostanza P. Nei tessuti colici prelevati da animali alimentati con HFD, i livelli di IL-1β e Il-6 risultavano significativamente superiori rispetto a quelli osservati nei tessuti ottenuti da animali SD. L’espressione dell’occludina nel tessuto colico ottenuto da animali HFD risultava significativamente ridotta rispetto a quella osservata nei tessuti prelevati da topi SD. Per verificare il coinvolgimento della glia nelle alterazioni di natura infiammatoria e funzionale osservate nel tessuto intestinale in seguito ad assunzione di HFD sono stati condotti studi su cellule EGC. Nelle EGC trattate con palmitato, è stato osservato un aumento significativo dell’espressione dei TLR-4 e un aumento della fosforilazione di JNK, mentre non sono state osservate variazioni significative dei livelli di IL-1β e sostanza P nel sovranatante cellulare. Nelle EGC trattate con palmitato e LPS è stato osservato un aumento significativo dell’espressione di TLR-4 e della fosforilazione di JNK, e un incremento dei livelli di IL-1β e di sostanza P nel sovranatante cellulare.
Conclusioni
L’assunzione di una dieta HFD determina la comparsa di dismotilità intestinale, a cui si associa un incremento della permeabilità dell’epitelio intestinale e della risposta infiammatoria, presumibilmente causati da una incrementata attività della glia enterica. In questo contesto le cellule gliali sembrano contribuire alla modulazione della contrazione tachichininergica attraverso un aumento del rilascio di sostanza P.
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