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Tesi etd-02132020-120218


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM6
Author
NATALI, ELEONORA
URN
etd-02132020-120218
Title
Oligomerizzazione delle FLC circolanti: impatto sulla diagnostica di laboratorio delle discrasie plasmacellulari
Struttura
RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
MEDICINA E CHIRURGIA
Supervisors
relatore Prof. Paolicchi, Aldo
relatore Prof.ssa Caponi, Laura
Parole chiave
  • mieloma multiplo
  • immunofissazione
  • SMM
  • proteinuria di Bence Jones
  • FPLC
  • catene leggere libere
  • immunoblot
  • FLC
  • discrasie plasmacellulari
  • MGUS
  • saggi immunochimici
  • oligomerizzazione
Data inizio appello
10/03/2020;
Consultabilità
Secretata d'ufficio
Data di rilascio
10/03/2090
Riassunto analitico
All’interno dell’eterogeneo panorama delle discrasie plasmacellulari, definite come proliferazione incontrollata di un clone plasmacellulare, producente immunoglobuline intere o parti di esse, il presente lavoro si è concentrato nella descrizione delle forme caratterizzate dall’iperproduzione di catene leggere libere delle immunoglobuline. In particolare, si sono esaminate sia le forme asintomatiche, ossia MGUS, molto diffusa tra la popolazione generale, e lo SMM, che la forma sintomatica del Mieloma Multiplo. Delle singole entità sono stati analizzati definizione, criteri diagnostici, prognostici e di evoluzione, mettendo in evidenza come un dosaggio accurato e sensibile delle FLC sia fattore fondamentale nel tailoring terapeutico, nello scoring prognostico e nella diagnosi differenziale delle differenti forme di MM. Siamo poi passati ad analizzare un’altra patologia dovuta all’implementata produzione di componenti immunoglobuliniche, ossia l’amiloidosi, gruppo eterogeneo di patologie, localizzate o sistemiche, caratterizzate dalla deposizione extracellulare di proteine fibrillari insolubili, con secondaria alterazione dell’architettura e della funzione dei tessuti coinvolti. Ci siamo concentrati particolarmente sull’ amiloidosi AL, data dall’assemblaggio e conseguente deposizione d’organo di FLC parzialmente degradate, assumenti la struttura tipica a β foglietto. Tali proteine, specialmente a livello cardiaco e renale, presentano un’importante tossicità sia diretta, data dall’effetto organotossico della deposizione di proteine a livello tissutale, sia indiretto, dato dall’attivazione del complemento e danno endoteliale derivanti dalla deposizione della proteina amiloidogenetica. In particolare il burden patologico a livello soprattutto cardiaco, ma anche renale, è fonte di morbilità e influenza fortemente la prognosi dei pazienti. Anche in questo caso sono stati esaminati criteri diagnostici, prognostici e di follow up di risposta terapeutica, dai quali ancora una volta emerge l’importanza, e la difficoltà, vista l’eterogeneità e la complessità di tali proteine, di trovare metodiche sensibili, specifiche, ripetibili, per fornire un trattamento e uno scoring prognostico adeguato ai singoli pazienti.
È stata inoltre descritta e una nuova entità, da poco definita dagli esperti, l’MGRS (Monoclonal Gammopathy of Renal Significance), che include tutte le manifestazioni renali derivanti da deposizione di componenti immunoglobuliniche, con relativi pattern anatomopatologici, clinici, e work up diagnostici, concentrandoci ancora una volta sulle forme causate dalle FLC.
Ampio spazio è stato infine dato alla disamina dell’importanza, nell’ambito di tali patologie, dell’accuratezza diagnostica, prognostica, terapeutica, visto l’impatto in termini di morbilità e mortalità e vista l’importanza di una diagnosi precoce. Sono state evidenziate delle criticità delle singole metodiche a disposizione per il dosaggio delle FLC sieriche e urinarie. In particolare si sono descritte, oltre alle classiche metodiche di elettroforesi e immunofissazione, anche le due metodiche immunochimiche nefelometriche automatizzate più utilizzate in diagnostica di laboratorio di queste patologie, mettendone in evidenza i grandi vantaggi, ma purtroppo le grandi criticità.
Infine sono state anche descritte, date le evidenze presenti in letteratura, possibili metodiche alternative di dosaggio delle FLC e campi futuri di applicazione, altri dalle casistiche sopradescritte, in cui le FLC sarebbero importanti fattori e causativi e prognostici di interesse.
Materiali e metodi: Abbiamo selezionato, tra i campioni urinari analizzati con immunofissazione urinaria presso il laboratorio di Patologia Clinica dell’AOUP tra il 13/04/2014 e il 28/06/18, 7 campioni urinari di pazienti presentanti proteinuria di Bence Jones. Sono stati scelti campioni urinari in quanto molto più vantaggiosi dei sierici, vista la minor concentrazione di proteine contaminanti, di più facile e meno invasivo prelievo. I campioni sono stati sottoposti, successivamente all’immunofissazione, dapprima a gel cromatografia per esclusione molecolare, in particolare con FPLC, per la separazione delle componenti proteiche in base al peso molecolare, rivelando le stesse a livello delle frazioni di eluizione tramite misurazione dell’assorbanza UV. Successivamente, sia i campioni interi che le frazioni derivanti dall’FPLC, sono stati sottoposti a corsa elettroforetica con metodica SDS-PAGE, con rivelazione della migrazione proteica con colorazione di Coomassie, e al Western Blot per la rivelazione della reattività specifica delle singole bande all’antisiero specifico per le catene leggere degli anticorpi.
I risultati di questo studio suggeriscono che proprio il diverso pattern di oligomerizzazione delle catene leggere, e la diversa proporzione con cui le singole forme di polimerizzazione si presentano nel singolo paziente possono spiegare le discrepanze tra i diversi metodi analitici utilizzati nel laboratorio clinico. L’oligomerizzazione delle FLC potrebbe influire sull’immunogenicità delle FLC, andando a mascherare o smascherare eventuali epitopi riconosciuti dagli antisieri specifici dei singoli kit, spiegando la discrepanza a volte anche molto significativa di reattività tra i singoli saggi sullo stesso paziente.
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