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Tesi etd-02052019-153209


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
JAUPI, ARDI
URN
etd-02052019-153209
Title
Effetti dell'invecchiamento sulla biosintesi della Melatonina e dei suoi precursori a livello retinico
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Prof. Saccomanni, Giuseppe
relatore Prof. Demontis, Gian Carlo Alfredo Giuseppe
Parole chiave
  • N-acetilserotonina
  • Melatonina
  • HPLC-FL
  • 5-metossitriptamina
  • Sistema retinico
Data inizio appello
06/03/2019;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
06/03/2022
Riassunto analitico
La melatonina o N-acetil-5-metossitriptamina (MEL) e le indolamine N-acetil- idrossitriptamina (NAS) 5- metossitriptamina (5MTAM) sono molecole prodotte in diversi organi e da diversi organismi. Nella ghiandola pineale Lla loro sintesi avviene principalmenteper via enzimaticaprocede a partire dal triptofano, mediante un processo di idrossilazione/decarbossilazione che porta alla formazione di serotonina; questa viene così acetilata dall'enzima AANAT sul gruppo amminico per formare l'N-acetil- idrossitriptamina (NAS), ed infine quest'ultima subisceche in seguito alla una O-metilazione da parte di ASMT in posizione 5 per formare la melatoninaMEL. La MELQuesta produttasi viene successivamente degradata dalla HIOMT e dalle MAO ed il prodotto è Laper dare 5MTAM. In letteratura viene riportata una possibile via sintetica alternativa della MEL, dove in cui la serotonina viene O-metilata portando alla formazione della 5MTAM che viene poi acetilata portando alla formazione della melatonina. La MEL èun neurormone, prodottao dalla ghiandola pineale è un neurormone, implicatao nel controllo del ritmo circadiano del sonno e della / veglia e quello annuale della riproduzione in alcune specie animali; inoltre nel sistema nervoso centrale (SNC) presenta una attività immunomodulatrice ed anti-infiammatoria. Alterazioni genetiche nella produzione di MEL sono state associate ad un aumento dell’incidenza di diverse patologie come le malattie psichiatriche e quelle neuro degenerative, suggerendo come questa molecola possa avere una certa responsabilitàun ruolo nella loro predisposizioneincidenza; infatti essa gioca probabilmente un ruolo importante come neuro protettore e nel controllo dell’accumulo di beta amiloide (Aβ42), proteina riscontrata che si accumula nel cervello di pazienti affetti dal morbo nella malattia di Alzheimer e probabilmente anche in quello di Parkinson. In aggiunta MEL controlla il ritmo riproduttivodi molti vertebrati,mediando l’effetto delle variazioni della durata della fase di luce secondo un ritmo circa annuale o stagionale.Oltre allLa ghiandola pineale, come anche altri organi quali la retina, la cute e le cellule del sistema linfatico sono sembrano in grado di produrre la MEL; recenti studi dimostrano come essa possa svolgerea un ruolo tessuto specifico. In tutti i tessuti la MEL viene prodotta in maniera ritmica, grazie in parallelo alla regolazione circadiana dell’espressione del gene Aanat ed alla stabilità dell’enzima AANAT. La MEL svolge la sua attività attraverso recettori specifici accoppiati a proteine G; recentemente è emerso che anche la NASè in gradodi interagire con recettori accoppiati G-proteine e con i recettori tirosinchinasici, Trkb del BDNF (Brain derive neurotrophicfactor). Infine, sia la MEL che il suo precursore NAS hanno azioni antiossidante, detossificante, antitumorale e potenziante del sistema immunitario.Nel caso del biomodulatore 5MTAM, questo presenta effetti inibitori sulle funzioni riproduttive, interagendo con recettori serotoninergici che modulano così sintesi, rilascio ed accumulo della serotonina;le sue funzioni nella retina non sono ancora del tutto chiare. Sia Nella retina la MEL che lae NAS sono prodotte nella retina, dove sono presenti recettori specifici per queste molecole che possono esercitare così la loro azione antiossidante; tali sostanze infatti sonosembrano capaci di proteggere i fotorecettori dallo stress ossidativo innescato dalla luce che viene focalizzata sui segmenti esterni dei fotorecettori ricchi di acidi grassi polinsaturi particolarmente suscettibili alla lipoperossidazione. Considerato che sia la NAS, sia 5MTAM, che la MEL, con diversi meccanismi, sembrano implicate nella funzionalità e nella vitalità delle cellule retiniche, si è ritenuto interessante, con questo studio, valutare la regolazione della produzione delle tre molecole a livello retinico, per ottenere utili indicazioni sul ruolo delle azioni mediate da recettori rispetto alle loro azioni antiossidanti.

Lo scopo di questa tesi di laurea è stato quello di determinare contemporaneamente in campioni biologici in doppio cieco la presenza delle tre indolamine MEL,NAS e 5MTAM; questo per valutare:
• la sintesi circadiana della melatonina nella retina e se questa avviene secondo segue una via sintetica canonica, come quella descritta per la ghiandola pineale;
• come la possibile variazione della concentrazione delle indolamine a livello retinico vari con l’età degli animali;
• il loro effettonelle insorgenze di patologie dell’organo stessola possibile modulazione della sua produzione in funzione di secondi messaggeri quali cAMP e Ca2+.
Per la valutazione quantitativa di MEL, NAS e 5MTAM mediante HPLC FL è stato utilizzato un metodo analitico messo a punto da due studi precedentemente condotti nel laboratorio di tesi oltre a quello già descritto in letteratura, attraverso l’utilizzo strumentale di HPLC FL. In questo studio iI campioni biologici utilizzati sono stati retine murine deiceppi C57BL/6,C57BL/10 e C57BL10/AJ che presentano differenzecontrariamente ad altri ceppi murini sono in grado di produrre sia nella produzione MEL che NAS. Il Mentre il ceppoC57BL/6 è incapace di sintetizzare MEL e NAS a causa di presenta mutazioni spontanee sia su Aanat che su Hiomt, mancando in questo caso la sintesi di MEL e NAS.Iil ceppo C57BL/AJ, ottenuto dall’incrocio di C57BL/10 e AJ è invece dotato sia di AANAT che ASMT funzionanti ,è disponibile in due varianti,(WT),in grado di sintetizzare normalmente le molecole sopramenzionate e (MUT), che presentauna mutazione del gene Cacna2d4 che codifica per la sub unità accessoria dei canali del calcio α2δ-4 che altera l’omeostasi del Ca2+ nei fotorecettori, cellule che producono NAS e MEL, modificandone la produzione rispetto ai WT.La provenienza delle retinein oggetto di studio e le loro analisi sono state eseguite in doppio cieco. L'isolamento di NAS, MELe 5MTAM dalla matrice biologica è stato condotto attraverso l’estrazione in fase solida utilizzando "cartucce" SPE Waters Oasis HLB. Previamente alla fase estrattiva in HLB i campioni sono stati preparati seguendo le linee guida sviluppate in laboratorio. Gli estratti cosi così ottenuti sono stati portati a secco sotto corrente di N2 e poi ricostituiti con metanolo.
In conclusione, con questo lavoro di tesi, è stato possibile valutare le variazioni circadiane dei livelli di MEL NAS e 5MTAM e i loro cambiamenti in funzione dell'età degli animali. calcolarne il E'stato inoltre possibile valutare se i livelli retinici di MLT derivino da una produzione locale piuttosto che dall'accumulo della MLT prodotta in altri organi. Irapporto a differenti tempi circadiani;i risultati ottenuti da tali analisti saranno utili per capire sotto una nuova luce la loro sintesi edcomprendere, anche attraverso futuri studi, i meccanismi di regolazione del sistema melatoninergico retinico e il possibile ruolo in processi neurodegenerativi a questo livello.
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