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Tesi etd-01252018-165225


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
GENUA, FLAVIA
URN
etd-01252018-165225
Title
Tipizzazione molecolare e caratterizzazione fenotipica di isolati clinici di Mycobacterium avium subsp. hominissuis
Struttura
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI
Commissione
relatore Prof.ssa Rindi, Laura
Parole chiave
  • analisi MIRU-VNTR
  • berberina
  • suscettibilità claritromicina
  • inibitore pompe ad efflusso
Data inizio appello
12/02/2018;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
12/02/2021
Riassunto analitico
Tra i micobatteri non tubercolari, batteri dotati di basso potere patogeno ad habitat prevalentemente ambientale, le specie appartenenti al Mycobacterium avium complex (MAC) rappresentano quelle più frequentemente responsabili di infezioni e malattie nell’uomo. Mycobacterium avium, uno dei membri del MAC, comprende 4 sottospecie: M. avium avium, M. avium silvaticum, M. avium paratuberculosis e M. avium hominissuis (MAH); quest’ultimo, in particolare, è considerato il più importante per l’uomo da un punto di vista clinico. MAH è un micobatterio patogeno opportunista; il suolo e l'acqua sono considerati i suoi serbatoi naturali e si ritiene che l'acqua potabile e gli aerosol siano le principali fonti di infezioni per l'uomo. Durante i primi anni dell'epidemia della sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), MAH ha causato infezioni disseminate in un'alta percentuale (25-50%) di pazienti con AIDS gravemente immunocompromessi; a seguito dell’introduzione di una più efficace terapia anti-retrovirale, la morbilità e la mortalità dell'infezione da MAH nei pazienti con AIDS sono state notevolmente ridotte e i tassi di infezione si sono stabilizzati a livelli bassi del 2,5%; tuttavia, MAH rappresenta ancora una minaccia per i pazienti di nuova diagnosi, per i pazienti che non possono sostenere la terapia anti-retrovirale o per i quali la terapia anti-retrovirale è inefficace. Nei pazienti immunocompetenti, MAH causa tipicamente infezioni polmonari nei soggetti anziani, linfoadenopatie localizzate nei bambini e, occasionalmente, infezioni dei tessuti molli.
Nel presente lavoro di tesi è stato intrapreso uno studio volto a caratterizzare da un punto di vista genotipico e fenotipico isolati clinici di MAH ed a valutare l’associazione della farmaco-resistenza con i diversi genotipi di MAH definiti secondo il metodo di tipizzazione molecolare denominato “MIRU-VNTR” (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units – Variable Numbers of Tandem Repeats), basato sul polimorfismo di loci genomici contenenti un numero variabile di sequenze ripetute. A tale scopo sono stati tipizzati, mediante l’analisi di 11 loci MIRU-VNTR, 71 ceppi MAH isolati da altrettanti pazienti in un periodo di 7 anni presso il Laboratorio di Micobatteriologia dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana; per tali ceppi è stata inoltre definita con il test colorimetrico in microdiluizione su piastra REMA (REsazurin Microplate Assay) la suscettibilità alla claritromicina, farmaco di prima scelta per il trattamento delle infezioni da MAH. Il DNA genomico estratto dai ceppi micobatterici è stato amplificato mediante reazioni di PCR per analizzare le dimensioni dei seguenti 11 loci MIRU-VNTR: 32, 292, X3, 25, 3, 7, 10, 47, MATR-1, MATR-7 e MATR-13. Inizialmente è stata valutata la diversità allelica (h) basata sia sul numero che sulla distribuzione degli alleli. I loci 32 e X3 si sono dimostrati altamente discriminativi con valori di densità allelica elevati (h pari a 0.52 e 0.63, rispettivamente); la diversità allelica era media per i loci 292 (h=0.26), 25 (h=0.25), MATR-1 (h= 0.25), bassa per i loci 10 (h=0.09), 47 (h=0.12), MATR-7 (h=0.15) e MATR-13 (h=0.04) e nulla nei loci 3 e 7. Nonostante questi limiti relativi al potere risolutivo di alcuni loci, l’analisi ha rivelato 24 profili MIRU-VNTR distinti. Di questi, 16 sono stati trovati in isolati singoli, mentre 8 profili erano condivisi da due o più isolati determinando 8 clusters che includevano 55 isolati. In particolare sono stati identificati due clusters costituiiti rispettivamente da 15 e 13 isolati, un cluster contenente 9 ceppi, 2 clusters di 5 ceppi, 2 clusters di 3 ed infine 1 cluster di 2 ceppi. Complessivamente, i risultati ottenuti hanno dimostrato un’elevata stabilità genotipica della popolazione dei ceppi di MAH circolanti nella nostra regione, suggerendo possibili fonti di infezione e vie di trasmissione per l’uomo specifiche a livello locale.
I 71 ceppi di MAH sono stati inoltre caratterizzati sulla base della suscettibilità alla claritromicina mediante un test in microdiuizione su piastra. Come atteso, solo una bassa percentuale (4.2%) degli isolati di MAH sono risultati resistenti alla claritromicina; tuttavia, la valutazione della minima concentrazione inibente (MIC) del farmaco ha permesso di individuare una certa variabilità del valore della MIC in relazione alla fascia di età dei pazienti. In particolare, MIC ≥ 2µg/ml sono state rilevate nel 90% dei ceppi isolati da pazienti pediatrici e nel 55% di ceppi isolati da soggetti anziani. Infine, non è stata osservata alcuna relazione tra profili genotipici MIRU-VNTR e MIC della claritromicina.
Successivamente, 13 dei ceppi MAH oggetto del presente lavoro di tesi sono stati inoltre impiegati per valutare l’attività antimicrobica della berberina, inibitore delle pompe ad efflusso, in associazione con la claritromicina. Tutti i ceppi sensibili alla claritromicina hanno mostrato una riduzione della MIC in presenza di berberina, dimostrando che quest’ultima agisce effettivamente sulle pompe ad efflusso presenti sulla membrana cellulare deputate all’estrusione della claritromicina, inibendone l’attività. Una riduzione dei valori di MIC della claritromicina in presenza di berberina è stata osservata anche per il ceppo intermedio e per uno dei tre ceppi resistenti. Nel complesso, i risultati ottenuti, se pur preliminari, vanno a sostegno dell’importanza degli inibitori delle pompe ad efflusso come possibili adiuvanti per il trattamento di infezioni causate da ceppi MAH resistenti ai macrolidi.


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